转ABCC2和ABCC4基因斑马鱼抗毒物积累特性研究

重金属、持久性有机污染物（POPs）和微囊藻毒素（MCs）等环境有毒物质可在鱼体内大量富集，从而污染鱼产品和危害人类健康。ABCC家族转运蛋白在组织防御和有毒物质解毒中具有重要功能。我们的前期研究发现，斑马鱼ABCC2和ABCC4在镉、汞和铅等有毒重金属解毒和排泄中发挥着重要作用。本项目以斑马鱼为模型，研究转ABCC2或ABCC4基因鱼的抗毒物积累效应及作用机理，主要内容包括：1）研制转ABCC2和转ABCC4基因的斑马鱼品系；2）研究转基因斑马鱼对有毒重金属、POPs和MCs的积累和排泄特性；3）研究ABCC2和ABCC4参与POPs和MCs解毒与排泄的分子机制。本项目的实施将进一步明确ABCC2和ABCC4在重金属、POPs和MCs等有毒物质解毒和排泄中的功能及作用机制，为培育抗毒物积累的水产养殖新品系提供理论依据，并对保护我国人体健康和促进水产养殖业发展具重要潜在意义。

环境污染导致重金属、微囊藻毒素（MC-LR）和持久性有机污染物（POPs）等有毒物质在自然水体中大量积累，这严重威胁鱼类生存与人类健康。ABCC2和ABCC4属于ABC转运蛋白C类亚族成员，作为多毒物耐受的主要因子，在毒物排泄、组织防御和信号传导等方面有着重要的生理学作用。研究表明斑马鱼abcc2和abcc4基因是哺乳动物ABCC2和ABCC4直系同源基因，也可能具有识别和转运多种毒物的功能。本项目通过转abcc2和abcc4基因斑马鱼品系的研制，探讨其在上述毒物解毒和排泄中的功能及作用机制。取得的研究结果如下：. （1）利用转基因技术研制出转abcc2和abcc4基因斑马鱼品系。首先构建了“全鱼”序列的转基因载体，即启动子和PolyA序列均来自鲤鱼β-肌动蛋白基因，在abcc2或abcc4编码序列的终止子引入了Flag标签序列用于表达分析。P0代转abcc2和abcc4基因斑马鱼阳性率分别为11.1%和22.1%，通过遗传性分析各获得了2尾和3尾能通过性腺传递的P0代转abcc2和abcc4基因阳性鱼。分别将可遗传的P0代亲本与野生型鱼配对繁殖，F1代转abcc2基因阳性鱼筛选的比率分别是63.31%和62.96%，转abcc4基因阳性鱼筛选的比率为43.75%、47.22%和52.08%。qPCR和Western bolt结果表明各有2尾F1代转abcc2和abcc4阳性个体能够有效表达。通过F2代有效整合的阳性鱼自交，分别获得了1尾转abcc2基因和4尾转abcc4基因纯合鱼品系。. （2）在LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎水平检测过表达斑马鱼Abcb4和Abcc4分别介导MC-LR、DDT和lindane等有机氯类农药外排的分子功能。研究结果显示MC-LR、DDT和lindane处理可分别诱导斑马鱼abcb4或abcc4基因在96-hpf幼体中的转录表达，过表达斑马鱼Abcb4或Abcc4能显著降低MC-LR、DDT和lindane的毒性效应及在LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎内的积累。. 综上，通过建立毒物耐受的过表达细胞系和转基因品系，为培育抗毒物积累的水产养殖新品系提供理论依据。