利用转基因和基因敲除斑马鱼研究Abcc4转运蛋白在微囊藻毒素排泄中的作用

Microcystin-LR (MC-LR) are substantially released into a water body during a period of toxic cyanobacterial blooms that caused by eutrophication in aquatic environment. These toxicants can be accumulated in fish and transferred along the contaminated fish products and thus pose adverse effects on public health. ABCC4 transporter that mediates multi-xenobiotic resistance (MXR) in mammals, has been reported to exert an important function in toxicants excretion. Our previous studies have shown overexpression of zebrafish abcc4 gene can significantly improved the survivability of ZFL cells exposed to toxic MC-LR, which suggests it may be involved in the efflux of MC-LR in fish. In this study, we plan to research on the ability and underlying mechanism of abcc4-transgenetic and knockout zebrafish models in export of MC-LR. Main contents of this project include: (1) developing the abcc4 gene knockout zebrafish strains; (2) investigating the roles and mechanism of Abcc4-overexpression and knockout in the efflux of MC-LR by utilizing the developed abcc4-transgenic and knockout zebrafish. These results will not only be helpful to further reveal the molecular mechanism underlying the transport and detoxification of MC-LR in fish, but also can provide theoretical foundation for breeding fish strains in preventing accumulation of MC-LR.

水体富营养化促进有毒蓝藻的水华爆发，产生的微囊藻毒素（MC-LR）可在鱼体内大量富集，从而严重污染鱼产品和危害人类健康。ABCC4转运蛋白作为介导哺乳动物对多毒物耐受性的主要因子，在毒物排泄中有着重要作用。我们前期的研究发现，过表达斑马鱼abcc4基因能显著增强ZFL（斑马鱼肝细胞系）对MC-LR胁迫的耐受性，推测其可能是参与鱼体对MC-LR排泄的重要因子。因此，本项目拟以斑马鱼为模型，研究转abcc4基因和abcc4基因敲除鱼对MC-LR的排泄特性及其作用机理。主要研究内容包括：（1）建立abcc4基因敲除的斑马鱼品系；（2）利用已有的转abcc4基因鱼和建立的abcc4基因敲除鱼，研究Abcc4蛋白过表达和缺失在MC-LR排泄中的作用及其机理。该研究结果将进一步揭示鱼类对MC-LR解毒和排泄的分子机制，同时为培育抗MC-LR积累的鱼类品种提供理论依据。

水体富营养化促进有毒蓝藻的水华爆发，产生的微囊藻毒素（MC-LR）可在鱼体内大量富集，从而严重污染鱼产品和危害人类健康。ABCC4转运蛋白作为介导哺乳动物对多毒物耐受性的主要因子，在毒物排泄中有着重要作用。研究发现斑马鱼abcc4基因是哺乳动物ABCC4的直系同源基因，且在转录水平显著受到MC-LR暴露的上调表达，推测其可能是参与鱼体对MC-LR排泄的关键解毒因子。本项目通过研制转基因和基因敲除斑马鱼品系，研究了Abcc4转运蛋白在MC-LR解毒和排泄中的作用。取得的研究结果如下：. （1）探究了MC-LR对斑马鱼肝细胞（ZFL）的毒性及毒性机理。结果显示MC-LR对ZFL的半致死浓度为80.123 μg/mL；用10 μg/mL MC-LR处理ZFL细胞，分别收集处理至0、3、6、12和24小时的细胞样品进行RNA-seq分析。测序共发现10209个基因受MC-LR的调控表达，其中在不同时间点上调基因的数量范围是2179至3202个，下调基因的数量范围是1501至2597个。此外，检测出1543个基因受到MC-LR的差异剪接，包括620个非差异表达基因。MC-LR的细胞毒性效应呈现高度的时间依赖性。MAPK和FoxO信号通路是显著受到MC-LR的上调表达，而类固醇生物合成和萜类化合物生物合成则是显著下调表达。根据基因簇表达谱构建了一个基因调控网络，并且鉴定出几个关键的候选转录因子。这些研究结果阐明了MC-LR对斑马鱼肝细胞的毒性效应及在转录水平的调控机理。. （2）采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，建立了abcc4基因敲除的斑马鱼品系；制备了斑马鱼Abcc4多克隆抗体，检测了敲除品系的蛋白表达情况；利用已有的转abcc4基因斑马鱼，在活体水平研究了Abcc4过表达和缺失在MC-LR排泄中的作用。结果显示与对照鱼比较，转abcc4基因斑马鱼对MC-LR的耐受性和排泄能力显著增强，而abcc4敲除斑马鱼对MC-LR的耐受性则明显降低。这些研究结果进一步揭示鱼类ABC转运蛋白对MC-LR解毒和排泄的分子功能，同时为培育抗MC-LR积累的鱼类品种提供理论依据。