刚地弓形虫profilin重组蛋白对雄性大鼠生殖功能的保护性研究

Toxoplasma gondii was an obligate intracellular parasitic protozoan of worldwide distribution ,its injury and prevention strategy on the reproductive system was always a problem concerned by society.There were many type of toxoplasma gondii vaccine studied at present, while the protection force were still not enough, and many of these studise only took protective antibody valence as evaluation index, that failed to consider the complexity of reproductive system regulation. Based on the early research on the abnormality of cykotines,the structure of testis,reproductive hormones after toxoplasma gondii infection, this project would obtain toxoplasma gondii profilin(TgPF) recombinant protein by gene engineering technology, the TgPF played critical roles in invading tissue cell barrier and regulating the host immune response for toxoplasma gondii, and we established chitosan modification liposome (CMLs) coating technology,taking the male reproductive system as the protection target, to evaluate the ability of CMLs-rTgPF inhibiting the toxoplasma gondii invasion of reproductive tissue barrier, to analyze its ability of maintaining stability on cytokines, reproductive hormones in body and reproductive system and the spermatogenesis. This project would provide scientific data for TgPF as toxoplasma gondii vaccine preferred protein, application of chitosan modified liposome technology and placed the focus of vaccine efficacy evaluation on reproductive system,that would provide a new ideas for the development of efficient vaccines and the evaluation of protective effect.

刚地弓形虫是一种世界性分布的专性细胞内寄生原虫，其对生殖系统的损伤和防治策略始终是社会关注问题。目前研究的弓形虫疫苗种类较多，但保护力尚不理想，且多仅以保护性抗体效价为指标，未能考虑生殖系统调控的复杂性。本课题以项目组前期对弓形虫感染致宿主细胞因子及睾丸结构、生殖激素异常等研究为基础，通过基因工程技术获得弓形虫profilin（肌动蛋白抑制蛋白，TgPF）重组蛋白，其在弓形虫侵入组织细胞屏障及免疫应答调控中均起至关重要作用，同时建立壳聚糖修饰脂质体（CMLs）包覆技术，并以雄性生殖系统作为保护目标，评价CMLs-rTgPF抑制弓形虫侵入生殖系统组织屏障的能力，分析其对机体及生殖系统局部的细胞因子、生殖激素以及生精过程的维稳能力。本项目将为rTgPF作为弓形虫疫苗优选蛋白提供科研数据，应用壳聚糖修饰脂质体技术并将疫苗保护效力评价重心置于生殖系统，为高效疫苗的研制和保护效力的评价提供新的思路。

刚地弓形虫（T.gondii）是一种细胞内寄生原虫，据估计全世界至少有l/3的人感染弓形虫。疫苗是弓形虫病防治策略的主要手段。弓形虫profilin（TgPRF）蛋白是其调节肌动蛋白聚合的关键蛋白，亦是虫体侵入宿主组织细胞屏障并激活免疫应答的重要因素。因此，本项目结合脂质体包覆技术对TgPRF作为疫苗备选蛋白进行研究。本项目通过表达、纯化rTgPRF并制备其多克隆抗体，体外实验证实TgPRF抗体具有直接抑制速殖子增殖的效力，并且其机制与TgPRF抗体抑制细胞坏死、促进凋亡的能力密切相关。通过体内对比实验显示，脂质体粒径对免疫效果有明显差异，400nm粒径的脂质体免疫效果更好且诱导以lgG2为主的抗体，而联合弗氏佐剂时同时诱导lgG1、lgG2。不同免疫方式均能提高CD4+T淋巴细胞比例，而CD8+T淋巴细胞无显著变化。小鼠保护性实验显示，400nm粒径脂质体疫苗比弗氏佐剂疫苗更能有效降低脏器（睾丸、肝、脑）虫荷。进一步研究发现，弓形虫感染小鼠睾丸内的睾酮（T）、双氢睾酮（DHT）均显著降低，促进生精过程启动的卵泡刺激素（FSH）升高，而免疫保护后可使感染小鼠的T、DHT及FSH均升高，不过无显著差异。同时，弓形虫感染小鼠的血清中促炎因子IFN-γ、IL-6、IL-23 p19显著升高，rTgPRF联合弗氏佐剂免疫可使这些因子进一步升高，而400nm粒径脂质体疫苗免疫使感染小鼠呈现更好的细胞因子平衡，IFN-γ明显升高伴随抗炎因子IL-10、TGF-β1及IL-22的增加，提示细胞因子平衡在改善免疫保护效力中的重要作用。值得注意的是，400nm粒径脂质体疫苗免疫后，睾丸组织内的促炎因子（IL-6、IL-23 p19和IFN-γ等）和凋亡均显著增加。我们同时以肝、脑进行对比，显示肝组织内促炎因子和凋亡明显减弱，脑组织促炎因子和凋亡仅小幅度上升，提示免疫调节的脏器特异性。结合睾丸病理观察，提示促炎因子和凋亡似乎在清除睾丸损伤细胞、维持细胞数量和激素水平平衡、促进生精中有重要作用。总之，本研究对脂质体疫苗的保护效力、机制和脏器免疫应答的差异性进行了较为详细的研究，为疫苗的进一步研究开发甚至rTgPRF及其抗体的综合利用提供了研究数据和基础。