新甲型H1N1流感病毒基因工程亚单位疫苗对抗病毒感染的研究

预防流感最安全和有效的措施是接种疫苗，然而当前流感疫苗生产的主流技术- - 基于鸡胚培养的流感疫苗生产技术存在诸多不足，已经成为限制现今流感疫苗产能扩大、品质提高和应急生产的瓶颈。本项目拟以新甲型H1N1流感病毒为模型株，分别借助酵母表达系统和昆虫杆状病毒表达系统制备出基于血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）的甲型H1N1流感基因工程亚单位疫苗和病毒样颗粒（Virus like particle，VLP）疫苗，并对疫苗在动物模型内诱导产生抗感染免疫应答的能力进行评价，特别是在分子水平上对病毒样颗粒疫苗在诱导免疫应答中的优势做一探讨。以期建立一个标准的、快速有效的流感病毒基因工程疫苗研发与评价平台。同时本项目还将借助制备的亚单位疫苗对现有的多种新型候选佐剂进行全面的评价，筛选出良好的安全有效的新型佐剂。为解决当前和今后流感疫苗的快速、规模化制备对抗流感流行做好技术储备。

本项目借助昆虫杆状病毒等表达系统制备出基于流感病毒HA保守序列和基质蛋白的病毒样颗粒（Virus-like particle，VLP）疫苗和亚单位疫苗，通过不同免疫方式、剂量及佐剂接种小鼠，检测小鼠体内的各项免疫学指标以及评价疫苗保护小鼠抗同源及异源流感病毒感染的能力。1、基于流感病毒基质蛋白的VLP疫苗。采用昆虫杆状病毒表达系统获得表达H1N1毒株M2 和M1蛋白的重组杆状病毒rBacmid-M2和rBacmid-M1，共同感染昆虫细胞得到M2/M1-VLPs。M2/M1-VLPs免疫小鼠后显示出良好的免疫原性，可有效诱导体液和细胞免疫应答并保护小鼠抵挡致死量同源和异源病毒攻击。2、基于HA保守序列的VLP疫苗。选取H1N1 HA三聚体茎部的保守氨基酸序列（HA2 76-130aa）插入到乙肝病毒HBc的主要免疫显性区域，利用大肠杆菌表达系统制备具有病毒样颗粒形态的重组蛋白疫苗（LAH-HBc VLP）。结果表明小鼠免疫后血清、鼻腔灌洗液特异性抗体都显著增加并诱导特异性的细胞免疫应答。该疫苗免疫降低了致死剂量同源病毒攻击的小鼠的死亡率,还可有效保护小鼠抵挡致死量异亚型H5和H9病毒攻击。过继实验结果显示血清和粘膜特异性抗体以及细胞免疫应答共同参与保护。还制备了基于H7N9毒株HA2 76-130aa的重组蛋白疫苗H7 LAH-HBc VLP,该疫苗在小鼠体内同样显示出良好的免疫原性，可以有效诱导体液和细胞免疫应答，并保护小鼠抵挡致死量同源病毒H7N9和异源病毒H3N2、PR8的攻击。3、基质蛋白亚单位疫苗。构建表达M1的质粒，在大肠杆菌表达系统中表达。纯化的蛋白辅以壳聚糖佐剂通过滴鼻的方式免疫小鼠。研究结果表明，流感病毒的M1蛋白不仅能对同源病毒（H9N2）的致死量攻击提供完全的保护，也能对异亚型病毒（H1N1，H5N1）的致死量攻击提供有效的保护。总之，研究表明，经昆虫杆状病毒和大肠杆菌等表达系统制备的基于保守序列或蛋白的流感病毒颗粒样疫苗和亚单位疫苗经粘膜免疫能在小鼠体内诱导特异性的体液免疫和细胞免疫，保护小鼠抵抗致死量同源或异源病毒的攻击，是很有前景的通用疫苗；同时，壳聚糖等是这些疫苗粘膜免疫的良好佐剂。本研究为制备新型的流感通用疫苗提供了有意义的实验参考。