食管癌乏氧微环境下通过外泌体传递microRNA-372诱导放射抵抗的机制研究

The mocelular mechanism and treatment strategy of radiation resistance in hypoxia microenviroment is still the focus and difficulty in the radiotherapy of esophageal cancer. Recent studies have shown that exosomes could play a pivotal role in hypoxia microenviroment by carrying various biological information materials. Our previous found that the exosomes released from esophageal cancer cells in hypoxia microenviroment could induce radiation resistance, which may be associated with cancer stemness. Besides that, microRNA-372 expressed highly in exosomes released from esophageal cancer cells in hypoxia microenviroment, it was associated with radiation resistance and could inhibit Krüppel-like factor 9(KLF9), the negetive regulate gene of tumor stemness. In this study, we hypothesis that the exosomes containing microRNA-372 released from esophageal cancer cells in hypoxia microenviroments could induce radiation resistance via tumor stemness. We will verify the above hypothesis by mocelular, cell, animal experiments and clinical specimens. This study could reveal a new mechanism of radiation resistance in hypoxia microenviroments and provide new strategies of reverse esophageal cancer radiation resistance.

乏氧微环境下放射抵抗的分子机制和应对策略是目前食管癌放射治疗亟待解决的难题。新近研究表明外泌体可通过携带各种生物信息物质在乏氧微环境下发挥重要作用。我们的前期研究显示：乏氧微环境下食管癌细胞可通过分泌外泌体诱导放射抵抗，且这一作用与肿瘤干细胞化相关。此外，乏氧食管癌细胞分泌的外泌体内microRNA-372高表达，其与放射抵抗相关且可靶向抑制肿瘤干细胞化表型的负向调控基因Krüppel样因子9（Krüppel-like factor 9，KLF9）。为此，我们提出假说：乏氧微环境下食管癌细胞可通过传递microRNA-372的外泌体调控受体食管癌细胞内KLF9表达，促进肿瘤干细胞化继而诱导放射抵抗。为验证这一假说，我们试图从分子、细胞、动物以及临床样本等多个水平来予以证实。本研究将从外泌体传递生物信息的全新角度揭示乏氧微环境下肿瘤放疗抵抗的机制，并为逆转食管癌放射抵抗提供新思路。

食管癌是世界范围内常见的致死性癌症类型，在中国，食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是食管癌的主要病理亚型。ESCC确诊时多为晚期，放射治疗是治疗ESCC的重要手段，但ESCC放疗后局部缓解率较低，5年生存率不足30%，因此阐明ESCC放射抵抗的分子机制至关重要。外泌体是直径30-200nm的细胞内源性的膜囊泡，含有蛋白质、脂质和包括DNA和RNA在内的多种核酸。源自肿瘤细胞的EV含有蛋白质和核酸，是细胞间通讯的关键介质，可促进肿瘤进展和治疗抵抗。microRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA在细胞生长、发育和衰老等生命过程中扮演着重要角色调节。我们的前期研究显示：乏氧微环境下食管癌细胞可通过分泌外泌体诱导放射抵抗。我们对乏氧与常氧条件下ESCC细胞TE13分泌的外泌体进行了测序，发现miRNA-340-5p与miRNA-372在乏氧外泌体中明显上调。随后我们又在TE1、ECA109两种ESCC细胞乏氧外泌体中进行了验证，发现miRNA-340-5p在三种乏氧外泌体中均高表达。我们通过采用microRNA敲除、克隆形成、细胞凋亡、Western blot、免疫组化等实验手段，在分子水平和细胞水平来探讨miRNA-340-5p对食管鳞状细胞癌生长和辐射敏感性的影响及其可能的机制。结果如下：在乏氧外泌体中敲低miRNA-340-5p可逆转乏氧外泌体传递的放射抵抗现象，在常氧的ESCC细胞中过表达miRNA-340-5p可导致细胞放射抵抗，抑制辐照诱导的细胞凋亡。miRNA-340-5p可与KLF10蛋白结合，降低KLF10及其下游UVRAG分子的水平，从而发挥放射抵抗的作用，体内实验也证实了这一发现。我们分析了88例接受根治性放化疗的ESCC患者血浆外泌体miRNA-340-5p水平，发现高表达患者的3年野内复发率增高，3年总生存率下降。综上所述，我们认为外泌体miRNA-340-5p可作为一种新的预测ESCC癌症预后的生物标记候选，并作为一种新的放射增敏靶点，是构成食管癌生物学复杂度的有前景的新组分。