线粒体蛋白PDHA2在减数分裂和piRNA形成过程中的功能及分子机制

Meiosis is a core part of spermatogenesis. PiRNAs are predominantly expressed in mammalian testis and can regulate meiosis and spermatogenesis. Mitochondria is the main organelle for piRNA biogenesis. Most recently, by employing mRNA interactome capture, we screened a mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex E1 alpha subunit PDHA2 from spermatocytes. PDHA2 is a potential RNA binding protein(RBP), expressed specifically in spermatogenic cells, and remains unreported regarding its function. We have established Pdha2 gene knockout mouse, which exhibits meiotic arrest, derepression of retrotransposon, abnormal distribution of mitochondria as well as piRNA-related factors, etc. In this project, we will dissect the phenotype of Pdha2 knockout mouse in detail, and use the methods including HITS-CLIP and co-IP to study protein-RNA and protein-protein interactions. Through intensive study of the mechanisms underlying PDHA2-mediated regulation of meiosis and piRNA biogenesis, we are looking forward to disclosing new clues for regulation of spermatogenesis.

减数分裂是配子发生的核心环节。PiRNA在哺乳动物睾丸中优势表达，能调控减数分裂和精子发生。线粒体是piRNA产生的主要细胞器。最近，我们通过mRNA相互作用组捕获法在精母细胞中筛选到线粒体丙酮酸脱氢酶复合物E1α亚基PDHA2。它是一个潜在的RNA结合蛋白（RBP), 在睾丸生精细胞内特异表达，其功能尚未报道。我们构建了Pdha2基因敲除小鼠,并观察到减数分裂障碍、反转录转座子激活、piRNA相关蛋白和线粒体的分布异常等现象。本课题将对Pdha2敲除鼠进行详细的表型分析，还将通过HITS-CLIP和co-IP等方法研究蛋白与RNA、蛋白与蛋白之间的相互作用。通过深入研究PDHA2调控减数分裂和piRNA合成的分子机制，我们希望为阐明精子发生的调控带来新的线索。

线粒体蛋白PDHA2如何介导减数分裂调控是本项目的核心科学问题， 而PDHA2作为非经典RNA结合蛋白（RBPs）的作用机理是本项目的特色科学问题。按照项目计划书，我们已完成构建Pdha2基因敲除（KO）小鼠模型、减数分裂精母细胞染色体铺片IF观测、PDHA2核定位发育动态观测、线粒体定位蛋白免疫荧光（IF）观测、piRNA同位素标记及转座子检测、PDHA2 免疫沉淀联合质谱分析（IP-MS）、 PDHA2同位素交联免疫沉淀（CLIP）靶RNA标记检测、PDHA2 eCLIP-seq联合转录组测序（ RNA-seq）生信分析、PDHA2 EMSA体外生化实验等一系列研究，从而阐明PDHA2调控精子发生减数分裂的作用及分子机理。项目书工作基础中曾介绍，PDHA2原先是我们通过“mRNA相互作用组捕获法在精母细胞中筛选到的非典型RBPs中的一个睾丸特异表达蛋白。我们目标完成一篇高水平论文的整体构架是包括最初的RBPs筛选鉴定、RBPs谱系征集研究、代表性RBPs功能（其中之一就是PDHA2上述研究）、RNA结合结构域（RBDs）谱系研究和鉴定等部分。因此，在本项目除支持PDHA2核心内容，也支持我们大力推进了目标论文的整体进展。除了完成上述较为直接的研究内容，我们同时开展了多个间接相关或支持性的研究，产出了不少相关方法学创建和应用方面的论文成果。其中，包括RBP/PDHA2课题所需同类技术方法的创建和应用包括：睾丸在体ASO/siRNA注射敲降法、CLIP同位素标记显影、睾丸eCLIP实验流程、蛋白纯化和体外生化；另外，还合作开发单细胞测序分析创新方法，研究精子发生表观/转录机制。综上，我们不仅按项目书中原先规划的主要内容顺利完成了年度计划，还在相关领域创建多个有价值的实验方法学和研究策略/思路，并用之于PDHA2及更多功能基因的研究。项目执行期间产出的多个研究成果为非典型RBPs在精子发生中作用机制研究不仅建立了新的研究范式，而且提供了新的研究资源。