MOV10L1介导合成的粗线期piRNA对精子发生表观遗传学的调控作用研究

PiRNAs（PIWI-interacting RNAs） play important protective roles in normal development of mammalian germ cells. A huge number of piRNAs are present in mammalian testis, yet our understanding of piRNA function and biogenesis remains at preliminary stage. Meiotic pachytene piRNAs in the testis are extremely abundant，which belong to a novel class of piRNAs with unknown function. We found MOV10L1 is a master regulator of piRNA biogenesis. Upon germline stage-dependent knockout of Mov10l1 gene, pachytene piRNA biogenesis can be totally blocked. Our data show that mRNA levels of some essential spermatogenic genes (such as Prm1, Tnp2, etc.)as well as DNA methyltransferases (DNMT3a, DNMT3b and DNMT1) are significantly altered in testes depleted of pachytene piRNAs. We hence hypothesize that pachytene piRNAs may play important roles in epigenetic regulation. This project aims to investigate whether and how pachytene piRNAs regulate germline epigenetics, by utilizing multiple approaches of molecular and cell biology including chromatin immunoprecipitation, DNA methylation analysis, and RNA in situ hybridization, combined with deep sequencing and bioinformatics.

PiRNA（PIWI蛋白结合的RNA）对生殖细胞正常发育具有重要的保护作用。PiRNA在哺乳动物睾丸内大量存在，但人们对其功能和生物发生机制的认识尚处在起步阶段。减数分裂粗线期的piRNA 丰度极大，是一类功能未知的新型piRNA。我们发现MOV10L1是一个调控piRNA合成的关键蛋白。在精子发生特定阶段敲除MOV10L1后，粗线期piRNA的合成完全受阻。我们进一步从基因表达的数据发现一些生精相关的必需基因（Prm1，Tnp2等）以及DNA甲基转移酶（DNMT3a，DNMT3b和DNMT1）的mRNA水平在粗线期piRNA缺失后的睾丸内发生显著变化，以此推测粗线期piRNA可能参与表观遗传学调控。本研究拟运用染色质免疫沉淀、DNA甲基化分析、RNA原位杂交等细胞和分子生物学方法，联合深度测序和生物信息学，研究粗线期piRNA是否以及如何介导生殖细胞表观遗传学调控。

哺乳动物睾丸减数分裂粗线期piRNA的生源论和功能不够清楚。本项目的一个核心科学问题是RNA解旋酶MOV10L1如何介导粗线期piRNA发生。另外，对原计划内容进行部分调整并延展。主要内容为：1）研究MOV10L1调控粗线期 piRNA发生的体内和体外分子机制；2）研究更多RNA结合蛋白调控睾丸发育和粗线期piRNA合成的作用机制；3）研究mTOR信号通路调控精子发生和粗线期piRNA通路的作用机制。我们通过HITS-CLIP、体外生化实验等关键技术获得几个重要结果：1）MOV10L1特异结合piRNA初级前体；MILI在Mov10l1突变体中不能正常结合piRNA中间体；RG4二级结构普遍存在于piRNA前体中；MOV10L1结合piRNA前体并促进其剪切。然后，表达并纯化MOV10L1蛋白，系统研究其在体外对RG4二级结构的解旋机制。提出MOV10L1特异结合RG4结构并调控由RG4介导产生piRNA中间体，从而更新了原先的MOV10L1-piRNA模型；2）MOV10L1同源蛋白MOV10在睾丸细胞中的生物学功能和机制均未曾报道。发现MOV10在细胞质和细胞核内都有定位；MOV10决定精原干细胞的增殖和最终命运；MOV10调控microRNA发生（可能包括部分piRNA）、3’-UTR长度和可变剪切等；MOV10与核内剪接蛋白因子相互作用。发现Pnldc1敲除后产生雄性不育表型，并出现转座子LINE1异常激活。进一步发现PNLDC1特异性参与长度为30-40 nt的piRNA前体3’末端的成熟过程，而对5’端没有影响。证明PNLDC1是参与piRNA3’末端加工的关键酶，是正常减数分裂和生育力必需的蛋白。该成果涉足“piRNA生源论”国际前沿领域。另外，证明SOX30在DNA水平上直接结合精子发生相关的一些重要基因的启动子而影响其转录水平，从而调控减数分裂后期向精子变形过渡的发育过程；3）发现对Rictor基因进行条件性敲除后，睾丸发育、血睾屏障（BTB）及相关基因的表达均产生了严重的影响；同时，建立并优化了体内观测BTB损伤程度的方法；根据piRNA相关蛋白的定位异常及piRNA水平下调，证明mTOR抑制剂Rapamycin在一定程度上削弱了piRNA发生通路。综上，本项目的多个研究结果为精子发生和piRNA发生机制的科学理论提供新的线索，并建立了新的理论。