过表达CX45联合HCN4基因转染对起搏细胞自律性的影响

通过慢病毒转染，我们获得了持续表达HCN2和HCN4的基质干细胞，建立了研究克隆离子通道的模型；HCN2和HCN4转染心肌细胞均可使自发性搏动频率增加，相关研究已发表SCI论著5篇，但和国外同行的研究一样，构建的生物起博效率偏低。对窦房结结构的研究发现,缝隙连接蛋白的分布模式，尤其CX45在窦房结细胞上的梯度分布，对心脏窦房结细胞能够不受周围心房肌细胞的超极化影响，而异向性传播去极化电流到周围组织，实现其起搏功能至关重要；目前在生物起搏领域的研究，很少涉及CX45，而且CX45分布的改变对生物起搏细胞功能（尤其自律性）的影响不得而知。所以，本研究的目的就是了解转染HCN4构建的生物起搏细胞过表达缝隙蛋白CX45对起搏细胞自律性的影响，观察过表达CX45缝隙蛋白能否加强起搏细胞与周边宿主细胞的信号传导，为最终构建的生物起搏细胞应用于临床治疗打下基础。

植入电子起搏器已成为治疗症状性缓慢性心律失常的首选方法，并取得很大的成功。然而，有限的电池寿命、缺乏对神经激素自动反应性、儿童期植入起搏器电极不能随身体的发育而相应变长等缺点使得人们迫切需要一种更理想的治疗方法。国内外的学者研究认为利用基因治疗和干细胞构建的生物起搏可能会成为电子起搏器最为理想的替代方法。对于生物起搏的研究尚处于初期，目前最主要的问题是生物起搏的长期效能。.本课题首先构建HCN4质粒，体外扩增携带HCN4基因的慢病毒，研究转染后对移植细胞生活的影响，利用全细胞膜片钳记录起搏电流，检测HCN4基因的表达情况，并观察其随时间的变化规律和体外实验和体内环境对它们的影响。同时构建CX45慢病毒质粒转染HCN4起搏细胞，观察连接蛋白在MSC上的表达对细胞间信号传导以及生物起博效率的影响，并将过表达CX45的HCN4起搏细胞注射到缓慢性心律失常模型猪心肌内，观察能否在体外和体内构建具有长期高效的生物起搏细胞, 取得了一系列研究成果。.1.成功构建穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4；使用慢病毒包装系统成功建立稳定的HCN4重组慢病毒，并申报和授权国家发明证书；.2.明确HCN4基因转染骨髓基质干细胞后的效果以及通道电流表达情况，构建的起搏细胞转染CX45基因后，阳性表达缝隙连接蛋白CX45、细胞间存在明确的信号传导以及心肌细胞动作电位的影响；.3.构建的起搏细胞在体动物试验，获得在体的异位心脏起搏点；免疫荧光检测到移植细胞存活；移植细胞与宿主细胞间存在缝隙连接和电信号传导，明确过表达连接蛋白CX45能增强细胞间信号传导及提高生物起博效率。.本研究表明慢病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性，这些解决了生物起搏长期有效性的问题；构建的起搏细胞在体动物试验，获得在体的异位心脏起搏点；免疫荧光检测到移植细胞存活；移植细胞与宿主细胞间存在缝隙连接和电信号传导，明确过表达连接蛋白CX45能增强细胞间信号传导及提高生物起博效率，为生物起搏最终应用于临床治疗缓慢性心律失常打下基础。.本项目研究成果已发表论文17篇，其中SCI收录11篇，授权国家发明专利2项，国际大会发言2次，获江苏省科技进步一等奖。培养2位博士生，3名硕士生；周亚峰副教授因为本课题的科研成果，在2012世界心脏病学大会（WCC）被WHF和AHA授予"WCC青年医师奖"。