GJA7与HCN4双基因转染MCSCs移植提高心脏生物起搏频率的研究

Biological pacemaker therapy has been a hot spot and emphasis of cardiac electrophysiology study in recent years. With the help of national natural science foundation we have successfully cultivated pacing cells derived from MSCs transfected with HCN4 gene in vitro. A biological pacemaker can be detected when these MSCs were transplanted to the ventricular muscle, but the pacing rate was much lower than the normal sinus rhythm. It may be the result of insufficient survival pacemaker-like cells and deficient electromechanical coupling with cardiomyocytes. Researches have demonstrated that gap junction protein Cx45 uniquely express in sinus node (SAN) and plays a key role in the electrophysiological properties of SAN. In order to establish an ideal pacemaker with better pacing frequency and persistence time, we set out to co-transfect GJA7 and HCN4 in canine marrow derived cardiac stem cells, and transplant them to the region where the atrioventricular node has been destroyed through self-assembling peptide scaffolds. Then we are going to monitor the trace of these transplanted cells within body through SPIO by MRI. This work will improve the study of biological pacemaker and facilitated its clinical application, which will make greater theory value as well as potential clinical practice.

心脏生物起搏是心电生理领域研究的重点之一。本课题组前期研究及国内外同类研究均显示，经HCN4基因修饰的MSCs在体外可分化为心脏起搏样细胞，将经HCN4基因修饰的MSCs移植至Ⅲº房室传导阻滞动物心室肌可重建心脏生物起搏点，但其频率较培养获得的心脏起搏样细胞搏动频率明显减慢，不能满足生物起搏功能需要。本项目通过对生物起搏功能低下的可能原因进行分析，提出了GJA7与HCN4双基因转染骨髓源性心脏干细胞（MCSCs）移植、提高生物起搏频率的新策略，并用水凝胶运载移植细胞、用SPIO标记细胞行MRI活体示踪观察等方法。其目的旨在提高移植细胞Cx45表达、促进移植细胞与宿主细胞间电-机械偶联的建立，防止移植细胞“流失”，使移植细胞在宿主体内长期存活并有效分化为心脏起搏样细胞，建立具有稳定、高效起搏功能的生物起搏点。本研究结果将为心脏生物起搏治疗缓慢性心律失常临床前研究奠定实验基础，具有重要意义。

心脏生物起搏是心电生理领域研究的重点之一。课题组前期研究及国内外同类研究均显示，经HCN4基因修饰的MSCs在体外可分化为心脏起搏样细胞，将该细胞移植至Ⅲº房室传导阻滞动物心室肌可重建心脏生物起搏点，但其频率尚难满足生物起搏功能需要。本项目针对上述问题，提出了GJA7与HCN4双基因转染骨髓源性心脏干细胞（MCSCs）移植、提高生物起搏频率的新策略，目的是提高移植细胞Cx45表达，促进其与宿主细胞间电-机械偶联建立，防止移植细胞“流失”，使移植细胞在宿主体内长期存活并有效分化为心脏起搏样细胞，建立稳定、高效的生物起搏点。我们以慢病毒为载体共转染hGJA7-RFP及hHCN4-GFP，并通过荧光显微镜及Q-PCR等证实了双基因在MSCs中正常表达，转染效率达到60%以上，还用膜片钳证实在25%-30%的双基因转染细胞中记录到If电流，且该比例显著高于单基因转染组。考虑到微环境对细胞分化的影响，我们将MSCs与大鼠心室肌细胞共培养，检测发现双基因转染组细胞自发收缩频率显著增加；且双基因转染组TBx3、TBx18、Cx43、Nkx2.5等起搏细胞标志物表达显著增高。考虑到c-Kit+的MSCs更具有向起搏样细胞分化的潜能，因此通过流式技术筛选出c-Kit+MSCs，并向其转入hTbx18，与窦房结细胞相比，转染hTbx18的MSCs表现出类似的If电流，并且细胞内cAMP水平、起搏细胞标志基因表达等均相似。此外MSCs采用注射移植易导致细胞流失，我们采用改性的壳聚糖温敏水凝胶，在证明其生物安全性的基础上，发现MSCs与凝胶溶液能良好的混合培养，且相同培养条件下，水凝胶组MSCs存活时间更长。通过研究证实 HCN4 与 GJA7 双基因共转染至犬 MCSCs，提高了心脏起搏样细胞分化效率，促进移植部位电-机械偶联的形成，这可能与TBx3、TBx18、Cx43、Nkx2.5等起搏样细胞相关基因表达上调相关。验证了水凝胶对于MSCs的生物安全性，及其延长MSCs存活时间和防止细胞流失的作用。此外研究还提示分离MSCs中更具有向起搏样细胞分化潜能的亚群，配合基因转染更有利于MSCs向起搏样细胞分化。该研究丰富了诱导MSCs向起搏样细胞分化的系统性手段，使得MSCs用于临床治疗慢心律失常向实际应用迈进。