敲除NKx2.5联合Shox2与HCN4双基因转染猪VSELs细胞构建生物起搏器

Establishment of a biological pacemaker is expected to solve the persisting problems of a electronic pacemaker including the problems of battery life and electromagnetic interference. But the existing study showed that the biological pacemaker of transfected single or double HCN gene with lentivirus or adenovirus vector to stem cells has lower efficiency of pacing. Shox2 and HCN4 have synergy effects, while short stature homobox2(Shox2) and NKx2.5 have antagonistic effect on cardiac pacing function of sinus node. Based on above problems and progress, adeno-associated virus(AAV) vector with Shox2 and HCN4 was in vitro transfected to swine VSELs with Nkx2.5 gene knockouted by CRISPR/cas9 technology. Expression of Shox2, HCN4, Nkx2.5 is tested at the level of mRNA and protein. The cell proliferation and transfection efficiency are compared. Further, the Shox2+/HCN4+/NKx2.5- VSELs are in vivo transplanted to the destroyed SAN surrounding of swine model with sick sinus syndrome by 3-dimensional mapping to get a long-term and stable biological pacemaker.

生物起搏构建有望解决电子起搏器的电池寿命和电磁干扰问题。但是现有结果表明，无论是单基因、双基因HCN转染的干细胞，还是基于慢病毒、腺病毒构建的载体所产生的生物起搏效率均偏低。矮小同源盒基因亚型(Shox2)和HCN4可在窦房结细胞对心脏起搏起协同作用，而与心脏同源序列转录因子(NKx2.5)起拮抗作用。基于此，本课题拟通过CRISPR/Cas9基因剪接技术构建Nkx2.5敲除的极小胚胎样干细胞(VSELs)细胞株，以腺相关病毒（AAV）为载体，将Shox2、HCN4转染至敲除了Nkx2.5的VSELs中构建生物起搏器，从mRNA和蛋白水平检测基因表达，并进行细胞形态学与电生理检测。进一步将Shox2+/HCN4+/Nkx2.5-组合协同优势的起搏样细胞于三维标测下在体靶向植入病窦综合征动物模型的损伤窦房结附近区域，在体研究起搏功能，为构建新一代稳定长效的生物心脏起搏器奠定实验基础。

生物起搏构建有望解决电子起搏器的电池寿命和电磁干扰问题。但是现有结果表明，无论是单基因、双基因HCN转染的干细胞，还是基于慢病毒、腺病毒构建的载体所产生的生物起搏效率均偏低。矮小同源盒基因亚型(Shox2)和HCN4可在窦房结细胞对心脏起搏起协同作用，而与心脏同源序列转录因子(NKx2.5)起拮抗作用。.本课题完成了将窦房结（SAN）起搏细胞与胚胎样干细胞(ESCs)共培养，进行蛋白提取，定量和Western Blot检测相关蛋白的表达验证测定；RNA的提取、逆转录和qPCR实验；提取SAN细胞外泌体，SAN细胞的外泌体与ESCs共培养，进行荧光定位，鉴定外泌体，用生物信息学方法分析并预测NKx2.5的序列可能的miR-127-5p结合位点，分别将片段插入到荧光素酶报告基因质粒，进行荧光素酶基因实验验证，流式分型和免疫荧光验证miR-127-5p靶向调节Nkx2.5，为检测ESCs分化过程中Nkx2.5表达，构建NKx2.5敲除稳转株，qPCR检测、Western Blot检测、流式检测起搏相关基因表达，测定心肌细胞搏动频率，证明miR-127-5p的过表达可抑制Nkx2.5的蛋白水平表达，进而促进胚胎干细胞的分化，为构建新一代稳定长效的生物心脏起搏器奠定实验基础。. 本课题组在研究中通过对诱导胚胎干细胞向起搏样细胞分化过程中第5天和第10天的细胞样本进行lncRNA高通量测序，发现一条基因编码为NONMMUG016749.2的lncRNA在第10天的细胞样本中表达降低最为显著，该lncRNA表达水平与心脏发育过程高度相关，故推测该基因可能抑制胚胎干细胞诱导分化为心脏起搏样细胞，将其命名为lncRNA RCPCD(Regulator of Cardiac Pacemaker Cells Differentiation)。免疫荧光原位杂交试验发现，lncRNA RCPCD定位于细胞核。过表达lncRNA RCPCD同时抑制了起搏基因HCN4、Cx 45、Shox2和Tbx3 mRNA和蛋白的表达，而敲低lncRNA RCPCD则表现出相反趋势。同时我们发现在胚胎干细胞向起搏样细胞诱导分化过程中HCN4启动子甲基化发生明显变化，随着lncRNA RCPCD表达升高，HCN4启动子区甲基化水平显著升高。本研究有助于建立一套长期稳定高效生物起搏技术体系。