不同时序艾灸延缓衰老的p16DNA修饰调控机制研究

Pilot study concluded that cellular senescence is the basis of aging body, and cellular senescence process achieves by means of signal transduction pathways. Tumor suppressor gene p16 is located in the important position of cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI) pathway, for its overexpression can induce aging. DNA modification is one of the p16 negative transcriptional regulation mechanism, and it is age-dependent. Perspective of prior study: signal transduction pathways. Research topics and research approach: the mechanism of anti-senescence effects of moxibustion treatment on ShenShu point(BL 23)Immunohistochemistry and further supporting biotechnology: Westernblot, HPLC, fluorescence, quantitative PCR, modification-specific PCR. Research objectives: to find out the actual relation between p16DNA modification and anti-senescence process of warm moxibustion treatment, and to further discuss the optimum time of moxibustion intervention. Research prospection: To provide evidence for anti-senescene effect of warm moxibustion on Shenshu(BL23) point.And to observe the differentiation targeting protecting and regulative effect of warm moxibustion on the main organs of rats in regard to the expression level of p16 modification. To examine the biological effects of moxibustion intervention on the epigenetic modification. The results will provide experimental evidence and theoretical basis to the study on anti-aging mechanism of acupuncture and moxibustion.

本课题组前期工作从信号传导调控角度研究艾灸延缓衰老作用及其原理，证实艾灸肾俞穴通过对细胞衰老信号p19/p53/p21传导途径的干预发挥延缓机体衰老的作用，同时在后续实验中观察到温和灸肾俞穴能有效地使衰老大鼠肝脏原本升高的P16蛋白表达下降。国内外研究表明，抑癌基因p16位于细胞周期依赖性激酶抑制因子(CDKI )途径的重要位置，其过度表达可诱导衰老的发生，DNA甲基化是p16主要负转录调控机制之一，并具有年龄依赖的特点，即随增龄而降低。因此，本研究拟以艾灸作为延缓衰老的干预方式，以p16DNA修饰为靶点，对其中的调控机制和时序方案进行深入研究，并以中医传统的肾虚致衰与脾虚致衰理论为依据，拟初步证明艾灸可通过调节p16表达，实现在衰老进程中对重要器官的本体靶向保护作用；阐释艾灸干预p16DNA甲基化修饰的生物学效应；探讨艾灸延缓衰老的适宜时机和腧穴配伍。

本实验应用表观遗传学技术与手段，通过采用不同时序、不同穴位艾灸，对温和灸干预延缓自然衰老大鼠p16DNA甲基化表现及其调控机制的修饰作用进行探讨，为艾灸延缓衰老的实际应用提供科学实验资料。.1..对衰老相关标志物的影响.随着大鼠月龄的增加，血清MDA含量升高。三种不同时序艾灸可降低衰老大鼠外周血MDA表达，其中以持续艾灸干预对衰老大鼠血清MDA含量的影响最优。.在衰老大鼠组织中衰老相关β半乳糖苷酶升高，SOD、PCNA的表达降低；三种不同时序艾灸可不同程度降低衰老大鼠β半乳糖苷酶的表达，改善衰老大鼠SOD、PCNA蛋白和mRNA的表达，总体以持续艾灸组为佳，时序1艾灸组效果明显。.而运用不同的腧穴处方可降低β半乳糖苷酶在肝、肾、海马三种组织的表达，并提高端粒长度，以艾灸足三里加肾俞穴为优。.2.对衰老大鼠肝、肾、海马p16mRNA的表达及p16DNA甲基化修饰的研究.在大鼠的肝、肾、海马中，p16mRNA及蛋白的表达随月龄增加而升高，三种不同时序艾灸均可降低衰老大鼠p16mRNA及蛋白的表达，总体以持续艾灸组较佳。p16DNA甲基化程度随月龄增加而降低，艾灸可不同程度改变衰老大鼠p16DNA甲基化程度。.3.对衰老大鼠肝、肾、海马p16蛋白、mRNA及DNA甲基化修饰特征的研究.运用不同的腧穴处方可降低p16mRNA及p16蛋白在肝、肾、海马中的表达；且自然衰老组大鼠p16 DNA CPG岛26个位点整体甲基化水平低于艾灸组；提示艾灸可通过干预p16 DNA CPG岛整体甲基化水平，降低p16mRNA及p16蛋白在衰老机体的表达，从而发挥延缓衰老的生物学效应。.4.对DNA甲基化调控的机制研究.衰老相关甲基转移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）的表达随月龄增加而降低，运用不同的腧穴处方可提高衰老相关甲基转移酶DNMT3a、DNMT3b的表达，且可同时提高转移酶的活性，以艾灸足三里加肾俞穴为优。提示艾灸可能通过干预衰老相关甲基转移酶的表达与活性从而对p16DNA甲基化进行调控。.研究结果为临床艾灸延缓衰老相关症状提供了科学证据，有助于推动艾灸在该领域中的进一步推广和应用。