基于补肾利湿法对痛风性关节炎NALPs信号传导通路的调控作用研究

前期研究已经确定补肾利湿法具有抗炎镇痛降尿酸作用，本项目将建立比较完善的动物和细胞的实验模型，运用免疫组化、RT-PCR及Western blotting法检测炎性因子及NALPs的mRNA和蛋白表达水平，应用蛋白芯片技术整体上检测细胞因子差异表达谱，确定痛风性关节炎的细胞因子标记物及补肾利湿法中药复方药效新靶点。同时对痛风性关节炎大鼠模型滑膜细胞进行原代培养，应用micRNA芯片技术，建立痛风性关节炎的micRNA差异表达谱，并预测差异表达的micRNAs的靶基因，筛选与NALPs差异表达有最大相关的micRNA-x,对比转染micRNA-x前后炎性因子表达，探讨NALPs 对炎性反应的调控机制，从而确定补肾利湿法中药复方对痛风性关节炎NALPs信号通路调控机制的影响，阐明其治疗GA的分子机制。本项目研究，将为探讨痛风性关节炎发病机制、诊断、治疗以及新药开发等提供理论依据。

痛风性关节炎（GA）是由于尿酸盐结晶沉积于关节所致的一种代谢性骨关节疾病，国外研究结果表明，以炎性体为中心的NALPs在激发炎症反应机制中起着重要的调控作用。我们针对这个信号转导通路进行了深入的研究。首先，本研究应用改良氧嗪酸钾盐和尿酸钠复合法诱发大鼠GA发生，应用补肾利湿法中药复方对GA大鼠模型进行干预，通过观察IL-1、TNF-α、caspase-1、MMP-7、TIMP-1、TGF-β、VCAM-1、IKB、COL-3等指标的变化，探讨补肾利湿法中药复方防治GA的作用机制；本研究采用蛋白质芯片技术探索GA的中具有诊断价值的生物标记物和中药复方对GA的治疗机制，提出了将3个细胞因子—CINC-3、Orexin A和Adiponectin确立为GA诊断标记物，研究这些炎性细胞因子的功能及作用将有助于明确GA的发病机制。其次，本研究发现尿酸钠晶体与细胞表面相互作用引发了参与GA炎症反应的各种细胞的4个信号，进而通过建立尿酸钠诱导的大鼠GA模型，用micro- RNA芯片筛选GA中的差异基因，微阵列分析大鼠关节滑膜组织中差异表达的miRNA，对差异表达的miRNA的可能靶标通过miRDB数据库进行了预测，首次发现三个miRNA(rno-miR-328b-3p, rno-miR-375-5p, rno-miR-299a-5p)在GA的滑膜组织中表达上调，三个(rno-miR-203a-3p, rno-miR-3085, rno-miR-19b-2-5p)下调，筛选与NALPs差异表达有最大相关性的miR-203a-3p，将是探索GA与miRNA相关遗传发病机制的关键。第三，本研究继而通过大鼠体内和大鼠滑膜细胞体外两方面，上调miR-203a-3p其表达后检测炎性因子的变化；同时转染NALP1、NALP3、NALP6，并给予补肾利湿法中药复方干预，探讨中药复方防治大鼠GA的机制，进而深入研究NALPs家族成员在GA中作用机理，在此基础上，提出补肾利湿法中药复方能够阻断NALPs蛋白的表达，可以阻断“NALPs-caspase-1-IL-1β”GA炎症信号通路，调节GA病变所致的炎症因子分泌紊乱，减轻GA炎症反应，达到防治GA的目的。通过本项目研究，探明补肾利湿法防治GA的药效物质基础及调控炎症因子表达的分子生物学机制，为中药防治GA提供了新的手段、方法和新的治疗靶点。