基于NALPs及其信号转导通路探讨“清热除湿通络法”治疗急性痛风性关节炎的分子机制

Based on the previous studies and NALPs and its signaling pathway and gouty inflammation research progress in the relationship of project group put forward a hypothesis:", clearing heat and removing dampness and dredging collaterals method" antagonistic gout mechanism may be associated with the regulation of NALP3 signaling pathway and its upstream and downstream related gene and protein expression have close relationship. " Clearing heat and removing dampness and dredging collaterals method" antagonistic gout is possible by interfering with NALP3 activation, the influence of inflammatory complex assembly or activation, inhibition of Caspase-1 activation, blocking IL-1 receptor pathway, thus negative regulation of IL-1 beta and other inflammatory mediators produced, mature or secretion, and suppression of inflammation or cascade amplification and clinical therapeutic effect. This project through the study of" clearing heat and removing dampness and dredging collaterals method" and the regulation of NALP3 signaling pathway and its upstream and downstream related gene, protein, using biological chip, RT-PCR and other molecular biology techniques screening model group, blank control group and experimental group PMN animal model of signaling pathways related to differences in gene and protein, clearing heat and removing dampness and dredging collaterals method to elucidate"" antagonistic gout molecular mechanisms, and further to explore the pathogenesis of gout provide direction, study can not only improve the traditional Chinese medicine theory, while the development of safe and effective drug prevention and treatment of gout has positive significance.

既往研究显示，"清热除湿通络法"能抑制痛风患者中性粒细胞的活化和向炎症部位的趋化、聚集，同时减少炎症介质的释放。在此基础上，项目组提出假说："清热除湿通络法"治疗痛风的机制可能与调控NALP3信号通路及其上下游相关基因和蛋白的表达有着密切的关系。"清热除湿通络法"治疗痛风有可能通过干扰NALP3活化、影响炎性复合体的装配或激活、抑制caspase-1活化、阻断IL-1受体等途径抑制炎症产生或级联放大而实现临床治疗效应。本项目通过研究"清热除湿通络法"与调控NALP3信号通路及其上下游相关基因、蛋白的关系，利用生物芯片、RT-PCR等分子生物学技术筛选模型组、空白组与实验组动物模型PMN中信号通路中相关的差异基因及蛋白，以阐明"清热除湿通络法"治疗痛风的分子机制，并进而为更深入地探讨痛风的发病机制提供方向，研究成果不仅可以完善中医药的理论，同时对开发防治痛风安全有效的中药新药具有积极意义。

本项目以大鼠气囊模型模拟痛风性关节炎，随机分为空白对照组、模型组、吲哚美辛组、秋水仙碱组、虎杖痛风颗粒组及其拆方组（清热组、除湿组和通络组），每组给予相应的干预方法。观察各组大鼠大体形态变化；采用HE染色、透射电镜观察大鼠气囊滑膜的组织形态学差异，检测气囊滑液的白细胞分类计数，采用PCR Array 法筛选出NALP3信号通路相关的差异基因，进而采用RT-PCR法验证差异基因mRNA表达，免疫组化、Western blot、ELISA检测相关基因蛋白表达及分布规律。以期验证“NALP3信号转导通路是清热除湿通络法拮抗痛风性关节炎炎症的主要分子机制途径”的假说，探索中医药治疗急性痛风性关节炎分子生物学机制。通过上述研究我们发现：①清热除湿通络法对NALP3炎性体具有抑制效应，其作用点可能重点在于NALP3蛋白，且从基因表达、mRNA转录及蛋白质翻译层面均具有下调作用。并且提示清热、通络方药的效果较除湿药物明显。对Caspase-1而言，清热除湿通络法的干预环节可能在蛋白翻译或活化水平。清热除湿通络法通过在基因表达、mRNA转录及蛋白质层面下调NALP3蛋白，在蛋白合成或活化水平下调Caspase-1，从而干扰了NALP3炎性复合体的装配或激活，进而发挥了拮抗痛风炎症的作用。②清热除湿通络法对痛风炎症效应分子IL-1β、IL-18蛋白均有明显的下调作用，其主要的作用位点可能不在基因和mRNA的转录环节，而在蛋白质合成、分泌以及活化过程中实现。结果还提示，清热药、通络药在下调IL-1β、IL-18水平时，效果优于除湿类药物。③清热除湿通络法对NF-κB1 mRNA转录具有下调作用，NF-κBIB表达随之下调，从而干扰了NF-κB信号通路的激活途径，减少炎症级联放大效应。其中，清热方组既能下调NF-κB1 mRNA表达量又能上调NF-κBIB mRNA的表达量，提示我们清热方药在急性痛风性关节炎的处方中扮演着不可或缺的角色。④清热除湿通络法可能通过干预NLRX1的基因表达、转录过程来实现抗炎效应，其中通络方组的水平与吲哚美辛相当，接近秋水仙碱，提示活血通络药物的应用在急性痛风性关节炎的处方用药中是不可或缺的。