小麦胚乳蛋白体的合成累积与品质形成的分子机制研究

利用本课题组经过多年培育的面筋品质具有显著差异的近等基因系CB037、CB037-A、CB037-A-B3h和CB037-A-B3-null作材料，采用双重免疫荧光染色技术（DIFS）、显微技术（TEM、SEM、FCM）、蛋白质组学技术(2-DE,HPCE,RT-HPLC,UPLC,MS/MS等)与分子生物学方法（qRT-PCR），研究籽粒不同发育时期蛋白体以及谷蛋白聚合体的累积与面筋品质的关系、谷蛋白基因在转录水平与翻译水平上的表达模式对胚乳蛋白体合成与累积的影响、分子伴侣（PDI、BiP）基因的表达对蛋白体大小与品质的作用以及谷蛋白磷酸化和糖基化修饰与面筋品质的关系等。首次从蛋白体的合成、累积的分子调控、谷蛋白亚基翻译后修饰等方面研究小麦面筋品质形成的分子机制，以期为小麦面包品质改良提供理论依据。

本项目研究了小麦优质面筋品质是如何形成的问题，在优质面筋品质形成的分子机制、优质亚基鉴定与基因克隆以及面筋品质鉴定技术方面取得了以下成果：.1. 建立了凝胶排阻色谱（Size-exclusion HPLC, SE-HPLC）分离谷蛋白大聚合体（GMP）的方法。该方法具有用量少、易操作的特点，可以用于品质育种的辅助选择。.2. HMW-GS 的亚基组成影响谷蛋白超GMP的形成。5+10亚基比2+12更容易形成超GMP，而且在籽粒的整个发育时期都参与超GMP的形成。.3. HMW-GS的表达量影响小麦籽粒中蛋白体（PB）的形成 HMW-GS数量越多，PB的数量也越多；HMW-GS亚基含量低的材料中形成的PB颗粒较小。.4. 分子伴侣Bip、PDI与面筋品质形成有关。从小麦中克隆的3个Bip基因具有完整的分子伴侣功能域，类似谷蛋白的表达模式以及定位在蛋白体表面的特点；3个二硫键异构酶PDI1-1、PDI3-1、PDI5-1与谷蛋白的转录同步。.5. 克隆了By18基因并开发了分子标记。从优质品系CB037-A-B3h中克隆了By18的完整序列，其序列与By8亚基仅有3个氨基酸残基的差异，这3个代换导致By18的迁移率以及疏水性不同于By8。针对3’端1976处SNP位点开发的引物能够从48个材料中将含有By18亚基的材料准确鉴定出来。.6. 鉴定与克隆了优质HMW-GS 1Slx2.3*和1Sly16*。两个高大山羊草1Sl编码的HMW-GS的导入显著地改善了中国春的面包加工品质，利用AS-PCR方法克隆了这两个基因的完整开放读码框。.7. 建立了LMW-GS原核高表达的方法。在谷蛋白基因之前添加一段几十到几百碱基易表达的DNA标签做前导序列，能够提高LMW-GS和醇溶蛋白在原核中的转录水平，产生了高水平表达的外源蛋白。.8. 立了UPLC分离LMW-GS的技术体系。具有分离速度快、重复性好、分辨率高的优点，被用于LMW-GS的染色体定位、基因型与环境的互作分析以及等位变异鉴定等方面。.9. 鉴定和克隆了6个潜在优质的HMW-GS基因。ASy15*、AKx1*、AKx3*、AKx2.3、AKy20* 和AKy8*均发现于小麦近缘种山羊草，其中AKy8*的重复区中含有一个额外的半胱氨酸残基，而AKx2.3的重复区较长，由816个氨基酸残基组成。