GJ的Ca2+传递引起钙稳态失衡诱导内质网应激在肝移植术后急性肾损伤中的作用研究

The early occurrence of acute kidney injury (AKI) after liver transplantation (LT) is the main reason for patients recovery delay and high post-operation morbidity, but the exact mechanism and preventive strategy is still obscure. Endoplasmic reticulum stress (ERS), contributing to kind of cell apoptosis process, was considered as the main cause of cell damage and cell death. Meanwhile, calcium dyshomeostasis was the central part of ERS. Of note, our preliminary study found that gap junction (GJ), the direct intercellular pathway for exchange of information, involved in the process of renal tubular epithelium (NRK52E cells) injury induced by bilirubin or lipopolysaccharide. Moreover, the damage process was accompanied by the alteration of intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i). GJ inhibitor could effectively decrease [Ca2+]i and expressions of CHOP and Caspase 12 protein, two ERS associated apoptosis protein. Based on the above, we hypothesize that the early AKI after LT is accommodated by ERS induced by GJ regulated calcium dyshomeostasis. Various methods, such as sepicific inhibitor, gene silencing and Cx32 gene knockout mice, will be applied to change GJ function, in order to clarify its effects and role in the development of AKI following LT and most importantly to verify whether GJ mediates AKI through modulating ERS associated cell apoptosis induced by GJ regulated calcium dyshomeostasis. This topic will provide valid basis and strong theoretical evidence for determination of mechanism and prevention measure for the occurrence of early AKI after LT.

肝移植急性肾损伤（AKI）是导致患者恢复延迟和死亡的主要原因，机制复杂且缺乏有效防治手段。内质网应激（ERS）是引起细胞损伤的重要原因，钙稳态失衡是ERS的中心环节，但抑制钙泵却未能完全恢复钙稳态，提示我们可能有其它通道参与。我们前期研究证明，缝隙连接(GJ)传递信号参与内毒素和胆红素诱导的肾小管上皮细胞损伤，GJ可以传递Ca2+，且抑制GJ可降低细胞内Ca2+水平，减少ERS相关凋亡蛋白CHOP和Caspase12的表达。据此，我们假设“GJ作为钙传递的另一通道引起钙稳态失衡，进而诱导的ERS是引起肝移植AKI的重要原因”。我们拟用胆红素和内毒素细胞损伤模型、野生型和Cx32-/-小鼠肝移植模型、结合基因沉默和质粒转染及改变GJ功能等技术，检测肾损伤、GJ的钙传递、ERS相关凋亡等指标来证明假说，阐明肝移植早期AKI的机制，为防治肝移植AKI提供有效干预靶点和理论依据。

肝移植急性肾损伤（AKI）是导致患者恢复延迟和死亡的主要原因，机制复杂且缺乏有效防治手段。内质网应激（ERS）是引起细胞损伤的重要原因，钙稳态失衡是ERS的中心环节，但抑制钙泵却未能完全恢复钙稳态，提示我们可能有其它通道参与。本研究假设“GJ作为钙传递的另一通道引起钙稳态失衡，进而诱导的ERS是引起肝移植AKI的重要原因”。本研究分两部分完成，1）在体动物学研究，建立内毒素血症小鼠模型，观察小鼠肾脏微循环变化和损伤表现；LPS刺激后肾脏的炎症反应和氧化应激，及使用GJ抑制剂和Ca2+拮抗剂后炎症反应和氧化应激的改变；建立肾脏缺血再灌注的小鼠模型，观察不同时期肾脏组织ERS相关凋亡蛋白（Caspase-3、GRP78、XBP1、CHOP）的表达；并使用Cx32基因敲除小鼠进行对比研究；使用ERS抑制剂验证ERS参与AKI；2）体外细胞学研究，观察缺氧复氧（H24R4）后肾小管上皮细胞（HK-2）生存率和凋亡程度；并使用Cx32基因沉默HK-2细胞比较观察；使用NF-κB抑制剂和p53抑制剂观察缺氧复氧后HK-2细胞的凋亡情况。结果发现：1）在体动物学研究部分，LPS刺激明显降低肾脏血流、增强肾脏的炎症反应和氧化应激，使用GJ抑制剂和钙离子拮抗剂的肾血流恢复、肾组织炎症反应和氧化应激明显减轻；缺血再灌注后的肾脏表现出明显损伤，且与Cx32的表达和ERS的活化程度相伴随，使用ERS抑制剂后LPS刺激的肾小管上皮细胞损伤和IRI后的肾脏损伤均明显减轻，Cx32-/-小鼠肾脏ROS的合成和分布减少，肾脏ERS明显轻于野生型，其细胞凋亡和肾脏损伤程度也明显轻于野生型，本部分结果说明Cx32介导的ROS/ERS/凋亡途径参与缺血再灌注后的肾脏损伤；2）体外细胞学研究，缺氧复氧后的HK-2细胞生存率下降、细胞凋亡明显，抑制Cx32的功能或者使用NF-κB抑制剂、p53抑制剂、ROS抑制剂都可以有效地抑制细胞凋亡和凋亡蛋白PUMA的表达，并减轻随后的AKI。本部分结果说明GJ传递伤害信号激活p53/PUMA介导通细胞凋亡在肝移植术后AKI中发挥重要作用。以上研究阐明肝移植早期AKI的发生机制，为从多途径减少肾实质细胞凋亡和防治AKI奠定了理论基础。