端粒酶Tert基因编辑猪细胞模型构建及猪早衰机制研究

Aging is one of the greatest risk factors for human disease. And the risk of cancer, diabetes, cardiovascular disease and Alzheimer's disease increase as the age increase. Telomerase reverse transcriptase (Tert) gene plays an important role in the process of aging, but the molecular mechanism is still not clear. Because pig is similar to human in physiology characteristics, it can be used as a good disease model. In this project, pig is chose to do our study. The Tert gene edited pig cell model is constructed using the CRISPR/Cas9 technology. We will try to analysis those gene related to aging using the comprehensive functional genomics, cell biology and bioinformatics methods in Tert gene edited pig cell model to reveal the molecular mechanism. At last, we will try to produce an early aging model using our Tert gene edited cells. The study of aging phenotype and mechanism will increase the success rate of model construction, and it will also guide us to the human aging mechanism research. Once we get the aging model successful, it will provide us a new ideal to study the mechanism of human aging-related diseases, and will provide a better model to development new drugs.

衰老是人类疾病最大的风险因子，肿瘤、心血管疾病和老年痴呆等的发病风险均随着年龄的增长而逐年增加。端粒逆转录酶(Tert)基因在衰老过程中发挥重要作用，但其调控动物衰老的相关分子机制尚未完全解析。猪的生理学等方面特征与人类相似，是人类疾病的理想模型。本项目拟以猪为研究对象，首先利用CRISPR/Cas9技术制备Tert基因编辑猪细胞模型；然后以此细胞系为核供体，制备出相应的胚胎，分别对其端粒长度和生理功能进行分析，找到影响胚胎发育的端粒长度临界点；其后综合功能基因组学、细胞生物学、生物信息学等方法对Tert通路与衰老相关关键基因进行检测，探究相关分子机制；最后尝试制备早衰猪模型。该早衰表型与机制研究一方面可提高早衰猪模型制备的成功率（如避免端粒过短导致克隆失败），另一方面可为人类细胞的衰老机制研究提供参考。如果该早衰猪能成功获得，其将为人类衰老相关疾病的机理研究与药物的研发提供新的思路。

衰老是人类疾病最大的风险因子，肿瘤、心血管疾病和老年痴呆等的发病风险均随着年龄的增长而逐年增加。端粒逆转录酶(Tert)基因在衰老过程中发挥重要作用，但其调控动物衰老的相关分子机制尚未完全解析。猪的生理学等方面特征与人类相似，是人类疾病的理想模型。本项目围绕Tert基因敲除模型猪的制备，Tert基因相关作用机制与Tert基因相关应用三个方面展开研究。Tert基因敲除模型猪的制备方面，首先成功获得猪Tert基因序列，针对猪的第一与第二外显子设计了相关sgRNA，并构建了相关表达载体，使用了双荧光筛选介导的双sgRNA删除方法，在猪成纤维细胞中进行了筛选，挑取了单克隆，分别得到了纯合和杂合的Tert基因敲除猪克隆细胞系，随后分别以纯合和杂合的Tert基因敲除猪克隆细胞系为核供体，采用体细胞克隆的方法制备克隆猪，最终成功获得3头Tert缺失的纯合克隆猪，与2头Tert基因缺失的杂合克隆猪，成功获得Tert基因缺失猪模型。Tert基因相关作用机制方面，本项目对猪的端粒长度变化进行了探究，我们在细胞与胚胎层面，对其端粒的长度进行了检测，结果显示，细胞克隆的端粒在胚胎中有所延长，分析原因是因为卵母细胞中可能残余有部分端粒酶，该项延长结果表明如果需要获得早衰表型可能需要通过Tert基因纯合敲除猪之间配种获得。最后在应用方面，本项目负责人与美国密歇根大学开展合作，尝试借助CRISPR技术对人宫颈癌细胞HeLa等细胞系的Tert基因基因进行敲除，结果显示当Hela细胞的Tert基因发生纯合敲除时，该癌细胞则会死亡，如将Tert基因杂合敲除细胞系注射进入裸鼠体内时，相较于野生型HeLa细胞系，Tert基因杂合敲除细胞的癌变显著得到了抑制，该项研究为未来癌症治疗提供了新的思路。综上，该项目将为人类衰老相关疾病的机理研究与药物的研发提供新的思路。