构建脂肪代谢相关基因pleg1敲除克隆猪模型

Lean pigs, meat quality and human obesity are all related to fat metabolism, in which identification of key genes involved, plays a critical role in pig genetic improvement and human obesity studies. In addition, a recent study showing that mice with null mleg1 can resist high-fat-diet induced obesity. This result implicates that leg1 gene might particulate fatty acid synthesis in higher vertebrates. Therefore, to better understand the relationship between fat anabolism and leg1 gene, we decided to construct a porcine pleg1 knockout model..Firstly, we utilize CRISPR/Cas9 technology to knockout pleg1 in pig fetal fibroblasts (PFF). After selection, PFFs with pleg1 knockout genotypes will be used as a nuclear donor to produce pleg1 knockout pigs using somatic cell nuclear transfer and embryo reconstruction/transfer;.Secondly, after genotyping of neonatal cloned piglets, RT-PCR and western blot will be employed to detect the expression of pleg1. Furthermore, histology on liver and salivary gland will be performed to show whether pleg1 gene could affect the development of these organs;.Thirdly, high-fat-food will be used to feed the cloned pigs. After several months, fat metabolism and deposition in these pigs will be analyzed based on the indices of growth traits, haemotology, and histology;.Fourthly, signaling pathways and pivotal genes will be identified and characterized;.Finally, using the pig model, we hope to demonstrate whether pleg1 is involved in pig fat metabolism. And based on the knowledge, we ultimately plan to breed lean/high meat quality pigs with proprietary intellectual property, or construct animal model for studying human obesity.

瘦肉型猪、肉品质、人类肥胖等当下热点问题都与脂肪代谢密切相关，因此鉴定脂肪代谢关键基因对猪遗传改良及研究人类肥胖具有重要意义。基于小鼠新基因mleg1突变体能抵抗高脂食物诱导的肥胖现象，我们推测leg1基因在高等动物中可能与脂肪合成相关，因此本课题拟通过构建pleg1敲除克隆猪来了解该基因与脂肪代谢的关系。.首先，我们在猪成纤维细胞中敲除pleg1，再通过体细胞核移植获得克隆猪；.其次，鉴定新生猪基因型，证明敲除个体pleg1表达下降，分析肝脏及唾液腺发育是否受pleg1敲除影响；.第三，对克隆猪进行高脂食物饲喂实验，通过生长性状、血液学、形态学分析敲除猪脂肪沉积和代谢的变化；.第四，研究与脂肪代谢相关基因及信号通路的变化，找到影响脂肪代谢的关键分子；.最终，通过上述研究判断pleg1是否参与脂肪合成，为最终培育有自主知识产权的瘦肉型/肉质改良猪及人类肥胖模型提供科学依据。

作为与人类肥胖、猪肉品质、瘦肉率等表型密切相关的脂肪代谢，一直是人类健康和畜牧生产中的重要研究话题。前期的工作中，我们观察到敲除小鼠mLeg1基因，能够使敲除小鼠抵抗高脂食物诱导的肥胖现象，说明LEG1基因可能是一种在哺乳动物中参与脂肪代谢的潜在重要基因。为了进一步研究LEG1基因及其家族成员的功能，为培育瘦肉型猪提供一条新的研究思路，本项目以猪pLEG1为主要研究对象，从分子和进化的角度对LEG1基因进行了初步解析。..利用分子生物学手段，我们首先发现与人类、小鼠不同，猪pLEG1基因有三个串联重复的拷贝；其中pLEG1a基因特异地表达于唾液腺中，pLEG1b与pLEG1a在基因和蛋白结构上相似，但是pLEG1b并不表达，而pLEG1c不仅缺少信号肽结构同时也没发现其能转录。同时，在体外细胞实验中，利用构建的表达载体，我们发现pLEG1a蛋白与小鼠和人类LEG1蛋白也是一种分泌型糖蛋白。这些结果说明pLEG1a可能与人hLEG1a、小鼠mleg1a直系同源，且功能类似。..为了验证这一结果，我们收集了NCBI数据库中所有的LEG1家族成员，并对其进行了分子进化研究。我们发现LEG1基因是一种进化上保守的基因，且在鱼纲斑马鱼中存在的zleg1a、zleg1b来自于物种特异性串联重复，而不是来自于鱼纲中普遍存在的全基因组扩增；在鸟类、爬行类、两栖类及茅尾鱼基因组中都只有一个LEG1拷贝，呈现共线性关系。在哺乳动物中，LEG1基因发生了两次串联重复，第一次发生于所有哺乳动物共同祖先，第二次发生于所有真兽亚纲共同祖先，导致了在鸭嘴兽、有袋类动物中有两个LEG1拷贝，而真兽中有三个LEG1拷贝。但是最终人类和小鼠只保留了LEG1a，而猪保留了所有三个拷贝（pLEG1a、pLEG1b和pLEG1c）。这一结果从进化的角度论证了hLEG1a、mleg1a和pLEG1a直系同源关系。..基于上述结果，我们选择了pLEG1a、pLEG1b为对象，利用CRISPR/Cas9技术高效地在猪成纤维细胞中敲除了pLEG1a和pLEG1b，并通过体细胞核移植构建了敲除克隆猪。通过对敲除猪的体重及血液生化指标检测，我们进一步发现敲除猪与野生型并无差别，这就说明在正常情况下，pLEG1的缺失不会对动物个体造成影响，从而为后续高脂饲料饲喂实验及最终判断是否能够培育瘦肉型猪打下基础。