柑橘属果实分泌囊细胞程序死亡的细胞和分子调控机制研究

Secretory cavities are the common structure in Rutaceae. The developmental types of secretory cavities in Citrus remain controversial. Our previous studies revealed that programmed cell death(PCD) involved in cell degradation during secretory cavity development. Chromatin condensation and DNA fragmentation were detected during nuclear degradation at the early stage of PCD through TUNEL assay. Meanwhile, we found that Caspase 3-like was directly involved in nuclear degradation and affected other organelle degradation. Moreover, the spatial and temporal distribution of Ca2+ was closely associated with morphological changes of nucleus. Also，Ca2+ regulated the degradation of nuclear chromatin and nucleolus. Unfortunately, these typically cytological characteristics and particularly the function of related gene knew little. In addition, the mechanism of vacuolar envelope destruction and their function in Plant PCD need further study. This project aims to investigate the cytological and molecular mechanism of VPE, Calcium-dependent endonucleases and Cell wall hydrolase respectively related to vacuolar destruction, nucleic acid degradation and cell wall degradation during secretory cavity development in Citrus grandis‘Tomentosa’and Citrus reticulata cv ‘Chachi’ by key gene clone, cytological location and underlying function, which will provide theoretical foundation to further explore the cytological and molecular mechanisms of plant PCD and to reveal the morphological nature and the developmental regulation of secretory cavities in Citrus.

分泌囊是芸香科植物普遍具有的结构特征，但有关其形成方式历来存在争议。我们前期的研究证明其分泌囊是以裂溶生方式发生。首次揭示出PCD参与了其细胞溶解过程。TUNEL检测表明细胞核破毁过程伴随着DNA断裂。同时，caspase 3-like直接参与了细胞核的降解。此外，Ca2+也参与了细胞核染色质和核仁降解的调控。果胶酶和纤维素酶分别参与了细胞壁中层降解和初生壁破毁。遗憾的是分泌囊形成过程中这些典型的细胞学特征，特别是相关调控基因的功能研究还十分缺乏。另外，PCD中植物特有液泡的破毁机制和功能还需要深入研究。本项目通过相关基因的克隆、细胞学定位和功能分析，重点研究柑橘类植物化橘红和广陈皮果实分泌囊PCD中液泡加工酶、钙依赖的核酸内切酶以及细胞壁水解酶分别参与植物PCD三个重要事件液泡破毁、核酸降解和细胞壁降解的细胞和分子调控机制，为揭示柑橘属分泌囊的形态学本质和发育规律提供更为丰富的理论依据。

分泌囊是芸香科植物普遍具有的结构特征，但有关其形成方式历来存在争议。我们前期的研究证明其分泌囊是以裂溶生方式发生。首次揭示出PCD参与了其细胞溶解过程。TUNEL检测表明细胞核破毁过程伴随着DNA断裂。同时，caspase 3-like直接参与了细胞核的降解。此外，Ca2+也参与了细胞核染色质和核仁降解的调控。果胶酶和纤维素酶分别参与了细胞壁中层降解和初生壁破毁。遗憾的是分泌囊形成过程中这些典型的细胞学特征，特别是相关调控基因的功能研究还十分缺乏。另外，PCD中植物特有液泡的破毁机制和功能还需要深入研究。本项目通过相关基因的克隆、细胞学定位和功能分析，重点研究了柑橘类植物化橘红和广陈皮果实分泌囊PCD中液泡加工酶、钙和锌依赖的核酸内切酶以及细胞壁水解酶分别参与植物PCD三个重要事件液泡破毁、核酸降解和细胞壁降解的细胞和分子调控机制，为全面揭示柑橘属分泌囊的形态学本质和发育规律提供更为丰富的理论依据。主要结果如下：.1、三个NAC转录因子通过调控Ca2+- and Zn2+-依赖的核酸酶协调参与了柑橘果实分泌囊细胞程序性死亡过程中核DNA的讲解。这些发现为解析不同离子依赖的核酸酶参与植物细胞程序性死亡过程中核降解提供了直接的实验证据。.2、利用定量PCR，原位杂交技术，TUNEL检测和电镜技术对柑橘分泌囊发育过程中CgPBA1的时空表达特征进行了系统研究，表明CgPBA1在植物中功能高度保守，它可能参与了柑橘植物化橘红分泌囊细胞凋亡过程中细胞核的降解。.3、果胶酶和纤维素酶参与了柑橘果实分泌囊细胞凋亡过程中细胞壁的降解，其中CisPG21和 CisCEL16是参与细胞壁降解的果胶酶和纤维素酶合成的重要调控基因。.4、利用细胞学和分子生物学技术对克隆的基因CgVPE1及CgVPE1在果实分泌囊细胞PCD过程中的时间和空间变化特征进行了详细研究。进一步的免疫细胞化学标记CgVPE1的结果首次在细胞学水平显示出CgVPE1主要定位于植物细胞的液泡中。随着液泡膜破裂，CgVPE1急剧减少。我们的结果表明化橘红果实分泌囊细胞PCD属于液泡破毁型PCD，CgVPE1可能参与了化橘红果实分泌囊细胞PCD中液泡的破毁。