基于细胞成像技术的益气活血方抗血小板活化钙信号转导和血栓形成作用机制研究

血管内膜受损或动脉粥样硬化斑块破裂后血小板活化、粘附，继发血小板聚集和血栓形成，引起暂时性或永久性的血流闭塞，使重要脏器发生缺血或梗死。血小板活化是由多种物质触发、由calcium ion参与的复杂的生物学过程，涉及两种钙信号转导途径：G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）和离子通道（ion channal），二者通过钙池控制通道相互影响。本项目基于细胞成像技术，利用人类脐静脉内皮细胞和血小板共同培养创建稳定的细胞标本以及大鼠肠系膜小动脉观察模型，动态观察益气活血方（黄芪、人参、赤芍、西红花）对体外血小板活化钙信号转导途径和体内血栓形成的影响，寻找益气活血方在受体水平的作用靶点，阐明其抗血小板活化和血栓形成的作用机制，弥补既往相关的描述性实验之不足，探讨益气活血理论、受体、血小板活化及血栓形成之间的联系，为临床用药提供理论依据。

本项目通过三年的研究工作，已完成项目计划内容。本项目基于细胞成像技术，建立了动物血小板提取和测试方法，从细胞水平测定外源性血小板膜受体激活剂作用于相应的膜受体时钙信号转导及益气活血方（黄芪、人参、赤芍、西红花）的干预作用；建立动物肠系膜小动脉血栓形成模型，从动物水平测试外源性血管损伤、血小板活化及血栓形成过程中钙离子信号变化，检测益气活血方对钙信号转导和血栓形成的干预作用，阐明其抗血小板活化和血栓形成的作用机制。结果提示，益气活血方具有抗血小板聚集、抑制血小板粘附的作用，且存在量效关系。同时MTT法提示，益气活血方可以降低血小板本身的活性，其作用与促进血小板内cAMP生成增多、TXA2生成减少密切相关。益气活血方对P2Y受体、凝血酶受体等GPCRs类受体具有拮抗效应，降低胞内钙离子浓度，利用西方印迹方法证实其作用与影响Orai1蛋白表达有关。总之，益气活血方通过调节cAMP、TXA2以及Orai1蛋白含量发挥抗血小板活化、血栓形成的效应，为临床用药提供了实验依据。