新型分泌蛋白LYG1抗肿瘤作用的免疫机制研究

Lysozyme is one type of glycoside hydrolase that hydrolyzes the β-1,4-glycosidic linkages in peptidoglycans and chitin. Human lysozyme G-like 1 (LYG1) is a typical secreted protein that belongs to the G-type lysozyme family. LYG1 was identified with the strategy of immuno-functional genomics by our group and the Department of Immunology, Peking University Health Science Center. Recombinant LYG1 protein could promote the production of IFN-γ from human CD4+T cells. Further studies show that LYG1 could increase the differentiation of both human and mouse Th1 cells in vitro, and the IFN-γ production from these cells. LYG1 could also promote the differentiation of mouse Th1 cell in vivo. Moreover, experiments from mouse tumor models revealed that recombinant LYG1 protein could obviously inhibit the growth of B16 melanoma, but had no direct growth inhibition to B16 melanoma cells. This suggested that the anti-tumor effect of human LYG1 might be mediated by the induction of host protective immune responses. The present study aims to further investigate the anti-tumor effect of LYG1 and its anti-tumor mechanism by using recombinant LYG1 protein, construct LYG1 transgenic and Lyg1 knockout mice. The discovery of LYG1 as a novel immune related molecule has important significance and potential application value because it deepens the anti-tumor effect of lysozyme family members, and offers novel idea about the anti-tumor mechanism of lysozymes.

溶菌酶是一类能够水解肽聚糖及几丁质中β-1,4-糖苷键的糖苷水解酶。人LYG1属于G型溶菌酶家族成员，是本课题组联合北京大学医学部免疫学系采用免疫功能基因组学策略发现的对免疫细胞活性具有重要调节作用的经典分泌蛋白。LYG1重组蛋白能促进人CD4+T细胞分泌IFN-γ、促进人和小鼠Th1细胞体外分化和IFN-γ分泌，以及促进小鼠Th1细胞体内分化。动物实验表明，LYG1重组蛋白能够明显抑制小鼠B16黑色素瘤生长，但对B16细胞本身无生长抑制作用，提示其抗肿瘤活性与激发了机体免疫保护反应有关。本项目拟进一步研究LYG1重组蛋白抗肿瘤效应、作用环节及机制；通过制备LYG1转基因及Lyg1基因敲除小鼠，进一步明确LYG1的抗肿瘤机制及阐明LYG1的功能。本研究发现的免疫新分子LYG1不仅拓展了溶菌酶家族成员的抗肿瘤作用，也为溶菌酶抗肿瘤活性的机制提供了新思路，具有重要意义和潜在应用价值。

LYG1是利用免疫信息学及功能基因组学平台筛选得到的具有抗肿瘤活性的潜在新细胞因子。LYG1为经典分泌蛋白，全长194个氨基酸，其中N端19个为信号肽，含溶菌酶样结构域，为溶菌酶G家族成员。LYG1在机体组织广谱低表达，在肾脏、睾丸中表达水平稍高，在LPS刺激的免疫细胞中表达下调。尽管属于溶菌酶超家族成员，但溶壁微球菌裂解实验表明LYG1无溶菌活性。LYG1在体外能显著促进正常脾细胞和初始CD4+T细胞分泌IFN-γ，并具有剂量依赖效应，但对CD8+T细胞IFN-γ的表达无影响。利用小鼠黑色素瘤B16细胞移植瘤模型发现，在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠中LYG1能够有效抑制黑色素瘤生长，且抗肿瘤效应具有剂量依赖性；LYG1能明显提高荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤引流淋巴结及脾脏中CD4+ T和CD8+ T细胞的数目，而B细胞和NK细胞数量不受影响；LYG1可促进荷瘤小鼠T细胞分泌IFN-γ，而对IL-4和IL-17无影响。在不同免疫细胞功能缺陷的SCID-beige小鼠，Rag1-/-小鼠和去除CD4+T细胞或者CD8+T细胞的小鼠中，LYG1的抑瘤作用消失，提示其抗肿瘤活性依赖T细胞。为进一步确认LYG1在抗肿瘤免疫中的功能，我们制备了Lyg1基因敲除小鼠。Lyg1基因敲除小鼠表型特征未见异常，且T、B细胞分化、发育能力未受影响。但是，与野生型Lyg1+/+小鼠相比，Lyg1-/-荷瘤小鼠的肿瘤生长速度明显加快，其肿瘤浸润细胞和脾脏中的CD4+T细胞和CD8+T细胞数目明显减少，两者的IFN-γ表达水平降低。进一步采用B16-OVA323-339肿瘤抗原特异性T细胞反应体系，我们发现LYG1能够显著促进肿瘤抗原特异性CD4+T细胞活化、增殖和IFN-γ表达，并具有剂量依赖效应。与体外结果不同，LYG1在体内可不同程度促进CD8+T细胞活化、增殖和IFN-γ表达。Lyg1基因敲除后可抑制肿瘤抗原特异性T细胞活化和IFN-γ表达。在Ifng-/-小鼠中LYG1抑瘤作用消失，提示IFN-γ为LYG1抗肿瘤活性的关键媒介分子。在小鼠Lewis肺癌细胞移植瘤模型中同样观察到了LYG1的抗肿瘤效应。综上，LYG1是一个具有细胞因子特性的分泌蛋白，其能够促进CD4+T细胞活化、增殖、产生IFN-γ，发挥抗肿瘤作用，在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。