沙眼衣原体新型分泌蛋白GlgA在致病机制中的作用研究

Chlamydia trachomatis is the leading cause of infectious blinding disease and bacterial sexually transmitted disease. Host inflammatory responses triggered by chlamydial intracellular survival and replication are thought to contribute to chlamydia-induced pathologies; the secreted proteins have been hypothesized to play important roles in this process. Base on our previously study on chlamydia glucose metabolism, we have found that C. trachomatis glycogen synthase (GlgA) to be a newly chlamydia secreted protein, which was localized in the organisms, lumen of chlamydial inclusions and in the cytosol of host cells, however, the roles of GlgA in chlamydial pathogenesis mechanism is still not clear. Therefore, we expect to adopt heterologous secretion system to study GlgA secretion pathway; use both yeast two hybrid and targeted proteomic to screen host cell interaction partner, then further analysis the influence of silencing target molecules on GlgA secretion, chlamydia infection, as well as cell apoptosis; reconstruct the chlamydia-derived plasmid pGFP::CM to express exogenous gene or antisense RNA of GlgA, then transform the plasmid-free Chlamydia muridarum to evaluate GlgA function by detecting ascending infection, pathogenicity, and secretion in mouse model. Aim to investigate the roles of GlgA on both cellular and molecular lever, as well as in vitro and in vivo, the expected results may beneficial in elucidate the pathogenesis of C. trachomatis infection, and may provide new ideas for the anti-chlamydia drugs and engineering vaccine development.

沙眼衣原体（Ct）是感染性致盲和细菌性性传播疾病的首位病因。Ct致病与胞内生长和复制密切相关，而分泌蛋白在这一过程中发挥着至关重要的作用。Ct糖原合酶GlgA是申请者前期研究发现的一种新型衣原体分泌蛋白，定位于Ct菌体、包涵体腔隙及感染细胞胞浆，其在Ct感染致病机制中的作用尚未见报道。本课题拟采用异源分泌系统研究GlgA的分泌途径；酵母双杂交和靶向蛋白质组学技术筛选鉴定与GlgA相互作用的宿主靶分子，研究RNA干扰靶分子表达对GlgA定位、表达时相、Ct感染率及细胞凋亡等的影响；并借助Ct质粒作为载体，构建GlgA单基因模型转化Ct质粒缺失株，感染Balb/c小鼠，体内研究过表达或沉默GlgA对Ct上行感染和致病力的影响。旨在从细胞水平和分子水平，体内和体外各层面探讨glgA的作用，有助于阐明Ct感染致病机制，并可能为新型靶向药物与基因工程疫苗提供新的思路。

沙眼衣原体（Ct）分泌蛋白在Ct与宿主细胞的相互作用及致病中发挥着至关重要的作用。GlgA蛋白是课题组前期发现的一种新的Ct分泌蛋白，其表达、分泌机制及在Ct致病中的作用还不清楚。本项目以GlgA为研究对象，首先对GlgA蛋白N端进行信号肽预测分析，然后用特异性阻断剂观察Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径对GlgA蛋白分泌的影响，再用噬斑筛选及穿梭质粒转化技术，构建Ct质粒缺失株和互补株，研究质粒对GlgA表达和分泌的调控作用；其次，从GenBank获取GlgA（CT798）基因全长序列，设计引物构建诱饵质粒pDBLeu-CT798，然后将诱饵质粒和构建在pEXP-AD502 载体上的HeLa细胞cDNA文库质粒共转染酵母菌株，选取三轮筛选阳性，且具备β-半乳糖苷酶活性的克隆测序，回转及GST pull down验证GlgA蛋白与靶蛋白之间的相互作用；最后，对质粒pBOMB4-Tet-mCherry进行改造，构建pBOMB4-Tet-mCherry-Δpgp6-GlgA自杀质粒，制备Cm GlgA单基因缺陷株及缺陷互补株，动物实验分析GlgA蛋白在鼠衣原体（Cm）生殖道感染和致病中的作用。此外，本项目还通过构建小鼠生殖道Cm感染模型，对Ct脂蛋白MIP和分泌蛋白Pgp3的联合交叉保护作用进行了探讨。研究结果表明：1. Ct糖原合酶GlgA蛋白N端无信号肽序列，蛋白的表达和分泌不依赖细菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途径，而与衣原体质粒密切相关；2. 成功构建了HeLa细胞cDNA文库及诱饵质粒pDBLeu-CT798，酵母双杂交技术筛选获得了17个靶蛋白，其中COPB通过回转及GST pull down验证；3. 成功制备了衣原体GlgA单基因缺陷株及缺陷互补株，并用动物模型证实GlgA蛋白在衣原体感染致病中发挥关键作用；4. Ct来源的重组MIP、Pgp3单独或联合免疫可诱导小鼠产生明显的抗Cm 交叉保护效应, 其免疫保护机制与诱导Th1型细胞免疫及高效价特异性抗体有关。该项目从细胞和分子水平，体内和体外各层面探讨了glgA的作用，有助于阐明Ct感染致病机制，并可能为衣原体新型靶向药物与基因工程疫苗提供新的思路。