质膜NADPH氧化酶参与硅诱导厚皮甜瓜果实活性氧积累及其机理的研究

NADPH oxidase (NOX) from plasma membrane had involved in ROS accumulation induced by silicon in muskmelon fruit. However, the types of NOX, regulation of its activities, and function of NOX have not been understood during the course of ROS accumulation in melon fruit treated with silicon. In this project, modern analyzed methods of TEM, RT-PCR, LC-MS/MS and Western blot are employed to reveal types of gene and protein of NOX implicated in ROS accumulation in muskmelon fruit elicited by silicon and/or diphenylene iodonium (NOX inhibitor) in molecular and biochemical level, and to explain the mechanism of ROS accumulation mediated by NOX and the proteins from plasma membrane involved in ROS accumulation. The objects of this project are to provide theory basis of function of ROS signal transduction from plasma membrane in muskmelon fruit treated by silicon, to understand deeply mechanism of induce resistance, and to develop new elicitors.

质膜NADPH氧化酶参与硅诱导厚皮甜瓜果实活性氧的积累，但参与此过程的NADPH氧化酶种类、活性的调节以及在质膜活性氧积累中作用机制尚不明了。本项目拟选用厚皮甜瓜果实为材料，通过硅结合质膜NADPH氧化酶阻断剂(DPI)处理，采用透射电子显微镜(TEM)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、蛋白质印迹(Western blot) 等手段，在分子和生化水平解析参与硅诱导厚皮甜瓜果实质膜活性氧积累的NADPH氧化酶基因与蛋白类型，明确参与活性氧积累的质膜蛋白组件及其调控活性氧积累的机理，为揭示质膜活性氧在硅诱导厚皮甜瓜果实抗病信号传递中的作用机制奠定基础，也为深入揭示诱抗机理及开发新型激发子提供理论依据。

以厚皮甜瓜为试验材料，通过硅结合质膜NADPH氧化酶阻断剂二苯碘及挑战接种病原物处理，利用透射电子显微镜、实时荧光定量PCR、多维液相色谱/串联质谱等手段，解析了参与硅诱导厚皮甜瓜果实质膜活性氧积累的NADPH氧化酶基因及其蛋白，分析了NADPH氧化酶参与硅诱导果实质膜活性氧积累的调节机理；通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱技术研究不同成熟度甜瓜果实NIV分布规律；采用主成分分析法和基于气相色谱与质谱联用技术(GC-MS) 的代谢组学方法，研究硅处理对甜瓜果实品质和代谢产物的影响规律；同时，以粉霉病菌Trichothecium roseum为对象，通过体外抑菌试验筛选了对T.roseum的孢子萌发和菌丝扩展具有抑制效果的药物，并探明效果最佳药物对菌体质膜完整性和表面超微结构的影响规律。结果表明：.1. 硅处理通过诱导超氧阴离子和过氧化氢等活性氧积累来增强对粉霉病的抗性，而活性氧积累主要通过果实质膜NADPH氧化酶家族中B、E-like和F-like成员来实现，并与质膜相关蛋白质的磷酸化过程相关。.2. 硅处理可以通过影响苯丙氨酸，嘧啶、精氨酸和脯氨酸等代谢途径来有效延缓果实色泽、味觉和质地等品质的下降；甜瓜果实粉霉病发生与NIV有关，且成熟度越高NIV积累越高，病部组织中NIV浓度最高，随着距离病部组织越远而逐渐降低。.3. 尼泊金丙酯钠、月桂酸、硅酸钾和香芹酚等药物对T.roseum的菌丝扩展、孢子萌发均有抑制作用，其中尼泊金丙酯钠效果最佳，可通过破坏T.roseum质膜和菌体表面结构来抑制生长。.综上所述，硅处理可以通过质膜NADPH氧化酶家族基因的表达来积累活性氧，该酶可与其他质膜蛋白发生作用启动果实抗病性；硅处理还能通过调节代谢产物对果实品质维持起到积极作用；真菌毒素可能是甜瓜果实粉霉病发病机制之一，还筛选到一些具有应用前景的控制粉霉病药物并明确了部分抑菌机理。