CDPK在硅诱导甜瓜果实抗病反应中的磷酸化修饰作用机理研究

Protein phosphorylation triggered by calcium ion signal is recognized as one crucial pathway to transfer the signal. Calcium signal and phosphorylated protein from plasma membrane involved in disease resistance induced by silicate in muskmelon fruit; however, the types of calcium-dependent protein kinase (CDPK), regulation of its activities, and function of phosphorylation modified by CDPK have not been understood during the course of induced resistance in melon fruit treated with silicate. In this project, muskmelon fruit are chosen as material, modern analyzed methods of TEM, RT-PCR, LC-MS/MS and GST pull down are employed to reveal types of gene and protein of CDPK implicated in disease resistance in muskmelon fruit elicited by silicate, Lanthanum chloride Ca2+ channel inhibit, 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB) CDPK block and challenged inoculation with pathogens in molecular and biochemical level, and to explain the mechanism of protein phosphorylation mediated by CDPK and the proteins from plasma membrane involved in disease resistance. The objects of this project are to provide theory basis of function of resistance signal transduction from plasma membrane in muskmelon fruit induced by silicate, to understand deeply mechanism of induce resistance and develop new elicitors.

由钙离子信号启动蛋白磷酸化是抗病信号传递的重要途径。硅诱导厚皮甜瓜果实抗病反应过程质膜钙离子信号以及与磷酸化相关蛋白均有调节，但参与此过程的钙依赖蛋白(CDPK)的种类、活性的调节以及在磷酸化修饰中作用机制尚不明了。本项目拟选用厚皮甜瓜为材料，通过硅结合钙离子通道阻断剂(LaCl3)、CDPK抑制剂(TBB)以及及病原物接种处理，采用透射电子显微镜(TEM)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、GST pull down等手段，在分子和生化水平解析参与硅诱导厚皮甜瓜果实抗病反应过程的CDPK基因与蛋白类型，明确其参与蛋白质磷酸化修饰的作用机理，为揭示硅诱导厚皮甜瓜果实抗病信号的传递作用机理奠定基础，也为深入揭示诱抗机理及开发新型激发子提供理论依据。

钙离子信号与蛋白质磷酸化参与了硅诱导甜瓜果实抗病性过程，但参与该过程的钙离子依赖蛋白(CDPK)及其在磷酸化活性修饰中作用机制尚不明了。项目以玉金香甜瓜果实为材料，通过硅结合钙离子通断阻断剂、CDPK抑制剂以及粉红单端孢接种处理，通过磷酸化蛋白质组学、基因克隆和实时荧光定量PCR等手段，解析了参与硅诱导甜瓜果实抗病反应中 CDPK基因类型和参与磷酸化反应的蛋白，分析了CDPK参与硅诱导厚皮果实抗病反应中磷酸化修饰机理。同时，以甜瓜粉霉病菌(Trichotechium roseum)为研究对象，利用Illumina HiSeq 2500和Pacbio RS Ⅱ测序技术对该病菌进行全基因组测序，采用生物信息学的方法和荧光定量PCR手段对全基因组的致病相关基因以及效应蛋白致病因子进行了预测和分析。结果表明：.1.硅处理可通过Ca2+-ATPase等活性来调节胞质钙离子浓度，并通过2、3和11等CDPK基因的表达来调节多种蛋白质的磷酸化与去磷酸化，参与过氧化氢等活性氧抗病信号的传递，最终启动果实的防卫反应。.2.T. roseum的全基因组大小为33.34 Mb，包含了19条scaffolds，预测得到8556个编码蛋白质基因，含有3601个结构域，其中7462个基因被COG注释，4331个基因被GO注释、2934个基因被KEGG注释。.3.从T. roseum的9760个蛋白序列中预测获得154个候选效应蛋白，功能注释64个，其中5个候选效应蛋白编码基因在离体诱导条件下和接种果实时相对表达量均显著升高。.综上可知，由CDPK调节的蛋白质磷酸化是硅诱导甜瓜果实抗病信号传递的重要途径，为深入揭示诱导机理及开发新型激发子提供了理论依据。此外，甜瓜粉霉病菌基因组测序相关结果表明，病原菌的次级代谢产物和效应蛋白是潜在的致病因子，可为进一步探明甜瓜果实-T.roseum互作机制奠定基础。