硼替佐米通过降解C-KIT诱导凋亡的作用机制及其作为胃肠道间质瘤治疗新策略的实验研究

干细胞因子受体C-KIT属III型受体酪氨酸激酶家族，超过75%的胃肠道间质瘤（GIST）患者具有C-KIT基因突变，且GIST的复发和耐药与C-KIT二次突变密切相关。我们前期工作中发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib，BOR）可降解白血病细胞系Kasumi-1细胞中的C-KIT蛋白，从而引起热休克蛋白HSP90去磷酸化，促凋亡肽激活因子Apaf-1的释放，进而引发细胞凋亡；BOR在GIST细胞株中也能够诱导C-KIT的内吞和降解。本课题在此基础上拟分别从GIST细胞株、原代GIST细胞和植入鼠模型等多个层面展开研究，采用免疫荧光、免疫共沉淀、免疫印迹及RNAi等方法深入分析BOR引起C-KIT内吞、降解及诱导GIST细胞凋亡的分子机制；观察BOR体内对GIST的抗肿瘤作用。开创以C-KIT降解为基础的靶向治疗新途径，为BOR治疗GIST的药物新用途研究奠定理论基础。

在国家自然基金的赞助下,我们顺利完成了课题原计划的内容。我们通过实验证实了达沙替尼可以增强硼替佐米对胃肠间质瘤细胞的杀伤作用。在我们的实验中发现，单用达沙替尼不能引起胃肠间质瘤细胞GIST-T1的凋亡，这与达沙替尼可以上调GIST-T1细胞内c-kit的表达有关。而单用硼替佐米可以导致GIST-T1细胞内c-kit的内吞并且下调，并且这是由c-kit内吞后与胞内泛素化连接酶E3结合导致的，并且可以引起部分GIST-T1细胞的凋亡。进一步实验证实了硼替佐米导致c-kit的内吞并且下调可以引起胞内Hsp90b的磷酸化水平增高，这会导致Hsp90b与凋亡诱导因子Apaf-1解联，后者可以引起细胞的凋亡。若连用达沙替尼和硼替佐米则可导致GIST-T1细胞发生显著的凋亡，我们通过实验证实这是因为达沙替尼在硼替佐米的佐助下可以通过PDFGRb引起细胞周期的阻滞，而这种周期阻滞则可以显著促进硼替佐米的促凋亡作用。