小胶质细胞中BTB蛋白KLHL32对TRPM2蛋白功能的调控机制

作为中枢神经系统的先天免疫细胞，小胶质细胞被氧化应激因子过度激活是老年性痴呆症、帕金森病与亨廷顿病等神经退行性疾病的主要致病因素之一。新近，在小胶质细胞中表达的TRPM2离子通道蛋白因其可被ADPR、Aβ多肽与过氧化氢等多种氧化应激因子激活而备受关注，被认为是氧化应激的细胞感受分子，与机体的免疫调节有着非常密切的联系。在前期的研究中，我们发现BTB蛋白KLHL32可特异性结合TRPM2蛋白并促进其发生泛素化修饰，可能是其特异性的E3泛素连接酶。本课题拟采用生物化学与分子生物学方法、生物质谱以及膜片钳等技术进一步研究小胶质细胞中KLHL32对TRPM2蛋白功能的调控机制及其生物学意义，旨在揭示TRPM2离子通道蛋白参与小胶质细胞氧化应激反应的调控机制，促进我们对神经退行性疾病发生发展机制的深入认识，为神经退行性疾病的防治提供新的理论依据。

本项目的主要目的是在前期通过酵母双杂交技术筛选发现BTB蛋白KLHL32是TRPM2离子通道蛋白潜在的相互作用蛋白的基础上，拟进一步证实它们之间的相互作用，并分析KLHL32蛋白对TRPM2蛋白功能的调控作用、以及氧化应激刺激对它们之间相互作用的影响。本研究成功地制备了抗KLHL32蛋白与TRPM2蛋白的兔多克隆抗体；分别采用免疫共沉淀与免疫荧光定位实验证实了KLHL32与TRPM2蛋白在细胞中存在相互作用，KLHL32作为特异性的E3泛素连接酶可促进TRPM2蛋白的泛素化修饰并使其通过泛素蛋白酶体途径被降解；采用H2O2刺激可诱导TRPM2蛋白丝氨酸磷酸化修饰并上调其在细胞膜上的表达水平，而采用可特异性激活蛋白激酶PKC的PMA处理同样可以上调TRPM2蛋白在细胞膜上的表达水平。此外，本课题还对小鼠不同组织中KLHL32表达水平进行了分析，结果显示其在脑组织中表达水平最高，其次为心脏与肾；而采用特异性配基ST-FLA激活TLR5受体可诱导经PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞中KLHL32 mRNA表达水平下调，其具体的生物学意义尚有待进一步的研究来阐明。已发表标注本项目的论文3篇，待发表论文1篇，主要的工作尚在总结中。