188Re联合肿瘤血管靶向生物制剂NGR-VEGI协同杀伤肿瘤的实验研究

肿瘤的生长、局部浸润与转移均依赖于新生血管的形成，抗血管生成治疗目前是肿瘤生物治疗研究领域的热点之一。然而目前的抗血管生成制剂或多或少存在靶向性差和直接杀伤效应弱等缺陷，如何使用单一制剂在提高靶向性的同时提高杀伤效应并降低毒副作用，实现恶性肿瘤的靶向联合治疗成为肿瘤治疗研究领域亟需解决的热点问题。本项目拟通过构建肿瘤血管靶向基序NGR和血管内皮生长抑制因子VEGI的融合蛋白，使用放射性核素188Re标记后获得188Re-NGR-VEGI，同时实现NGR基序介导的肿瘤靶向给药，不仅通过VEGI抑制了肿瘤血管形成，而且通过188Re对肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞进行内照射并诱发细胞凋亡，以期用最小剂量的药物达到诱发肿瘤消退的目标。本项目的顺利实施不仅能为现代肿瘤治疗开辟新的思路，而且将为研发一种新型多功效抗肿瘤血管分子靶向候选药物奠定实验基础。

采用大肠杆菌喜爱的编码密码子合成NGR-VEGI全基因序列，5’端融合NdeI酶切位点，3’端融合XhoI酶切位点，进行双酶切，装入PET-28a载体，利用载体上的序列，N端融合His-Tag用于亲和纯化，序列测定证明序列正确。将含有NGR-VEGI的PET-28a转入BL21菌株，IPTG诱导NGR-VEGI在细菌中表达，Glyko BandScan 5.0分析软件测定NGR-VEGI的表达量约为10.5%，大量合成融合蛋白，产量～100mg/L。开展131I对NGR-VEGI的标记研究，利用Iodogen直接标记法对NGR-VEGI进行131I的标记，标记率约为90%且稳定性好。HePG2荷瘤裸鼠经尾静脉注射131I-NGR-VEGI后显像发现注射早期未见显像，12小时后可见肿瘤部位显像。预锡化法探索188Re标记NGR-VEGI的方法，radio-TLC法双液相体系测定188Re-NGR-VEGI标记率高且稳定性好。188Re-NGR-VEGI能与HepG2细胞特异性结合,Kd值约为5nmol/L。流式细胞技术检测HUVEC细胞生长抑制效应，证实携带NGR靶向分子的融合蛋白标记治疗性核素后其生物学作用明显改善。荷瘤裸鼠经尾静注射7.4MBq (0.2 mL)的188Re-NGR-VEGI显示4h肿瘤即可显影，12h肿瘤最为清晰，24h肿瘤仍显影。4T1乳腺癌荷瘤BALB/c小鼠，尾静脉注射188Re-NGR-VEGI0.3mCi（～0.2ml）SPECT进行成像观察188Re-NGR-VEGI的体内生物特性，可见肿瘤部位注射后1h起开始有放射性浓聚，24h时肿瘤仍然可见，证明纯化后蛋白进行标记后具有肿瘤靶向性。瘤体约0.1cm×0.1cm（长×宽）时经尾静脉注射不同药物进行处理，分别为：空白对照组（NaCl 200μl），NGR（200μg），NGR-VEGI（200μg）和 188Re-NGR-VEGI组（14.5MBq）。结果显示四组瘤体体积变化P<0.05，中位生存期分别为37.5d、37.5d、39d和48d（P<0.05），可见188Re-NGR-VEGI组小鼠生存期明显延长，证实治疗性核素联合有肿瘤治疗作用的蛋白进行生物治疗，治疗效果明显提升。188Re-NGR-VEGI具有标记率高、稳定性好的优点，有可能会成为肿瘤内放射靶向治疗的新药物。