大麦条纹花叶病毒(BSMV)对玉米致病性差异关键氨基酸的定位及其分子机制分析

Barley stripe mosaic virus (BSMV) North Dakota 18 (ND18), Norwich (NW), Beijing (BJ) and Xinjiang (XJ) isolates elicit different phenotypic responses on maize inbred lines B73. The ND18, BJ and XJ strains are unable to infect the inbred line B73 and produce no visible symptoms or virus, whereas the NW, XJ and BJ strains are virulent and results in an intense mosaic and stripe phenotypes accompanied by large amounts of virus. In this proposal, based on the infectious cDNA clones of BSMV ND18 and NW isolates, we tried to precisely mapping the pathogenicity determinant and its key amino acids to maize inbred line B73 in the genome of BSMV through the reassortment of different RNA components (alpha、beta and gamma) recombination of different fragments in the same RNA component, as well as site-directed mutation of specific amino acids. The characterization of the viral pathogenicity determinant will be analyzed through biochemical analysis to see whether it could be subject to post-translational modification (eg. phosphorylation), and the effect of the modification of viral protein on the infectivity of BSMV will be further validated. Using yeast two hybridization and so on, maize proteins that interact with the viral pathogenicity determinant will be screened from the cDNA library of maize inbred line B73, followed by analyzing its function during the infection and cell-to-cell movement of BSMV, thus providing new scientific evidence for further understanding the molecular mechanisms involved in BSMV-maize interaction.

大麦条纹花叶病毒(BSMV) 不同的分离物存在明显的寄主范围差异，ND18分离物不侵染玉米自交系B73，而Norwich、北京和新疆分离物可以系统侵染B73。本申请课题拟利用已有的BSMV ND18分离物和Norwich分离物的侵染性cDNA克隆，通过不同RNA组分 （alpha、beta和gamma）的重配、同一组分不同片段的重组以及对差异氨基酸的定点突变，精确定位BSMV病毒基因组上对玉米自交系B73的致病决定因子及其关键氨基酸；分析BSMV对玉米致病决定因子是否存在蛋白质的翻译后修饰（磷酸化等），并通过实验验证翻译后修饰对BSMV侵染性的影响；利用酵母双杂交等方法，从玉米自交系B73 的cDNA文库中筛选与致病决定因子互作的玉米蛋白，并分析其在病毒侵染和胞间移动中的作用，为深入理解BSMV与玉米互作的分子机理提供新的科学证据。

大麦条纹花叶病毒 (Barley stripe mosaic virus, BSMV) 不同分离物存在明显的寄主范围差异，ND18分离物不侵染玉米自交系B73，而Norwich、北京和新疆分离物可以系统侵染B73。本课题拟定位BSMV对玉米致病性差异关键氨基酸，并分析其分子机制。.主要研究结果如下：.(1) 利用BSMV不同分离物的侵染性cDNA克隆，通过不同RNA组分（、和）的重配、同一组分不同片段的重组以及对差异氨基酸的定点突变，将BSMV对玉米自交系B73的致病关键氨基酸精确定位于TGB1的404位氨基酸；.(2) BSMV的TGB1蛋白能被寄主体内的CK2激酶磷酸化修饰, T401 (新疆分离物) 是CK2的主要磷酸化位点，T395是CK2的锚定 (docking) 位点。TGB1的磷酸化位点的突变显著影响BSMV在单子叶和双子叶植物上的胞间移动和长距离运输，首次揭示了磷酸化在BSMV的侵染和移动中的作用机制。.(3) TGB1主要存在于细胞质中，新发现TGB1也可定位于细胞核和核仁中，是一种核质分布的蛋白。明确了TGB1存在核仁定位信号NLS-A (aa 95-101) 和核定位信号NLS-B (aa 227-233)，证明TGB1的核核质穿梭是BSMV系统运动所必须的。TGB1和核仁纤维蛋白Fibrillarin直接互作，在胞质中形成RNP并参与病毒的胞间移动和长距离运输。.(4) 此外，首次明确了BSMV的复制位点在叶绿体上，BSMV的γb蛋白能与复制酶αa蛋白发生直接互作，在复制过程中γb蛋白被招募到叶绿体膜内陷形成的复制泡中。复制泡这个特定的空间里，γb蛋白通过其强的ssRNA结合活性, 稳定αa蛋白的解旋酶解开的ssRNA，从而促进病毒RNA的复制。γb蛋白作为一个解旋酶的增强子直接参与病毒的复制，这在植物病毒中尚属首次报道。.(5) 通过Co-IP和酵母双杂交，并经生物学功能初步验证，筛选出一些可能与TGB1蛋白互作的寄主蛋白。如： RanGAP2，过氧化氢酶（Catalase），硫氧还蛋白 (Thioredoxin M2) 等。