油包水乳化体系中新型交联酶聚集体的构建及其结构与性能

交联酶聚集体（CLEAs）是一种高活性的无载体固定化酶，但现有方法制备的CLEAs易被压密或团聚成无定形的集簇体，影响其连续使用效率。为此，首次提出乳化法构建微球型CLEAs的思路。以海藻糖合酶为模型酶，利用激光扫描共聚焦、扫描和透射电镜及傅立叶红外光谱分析微球型CLEAs的微观结构、zeta电位、与游离酶相比二级结构的变化等结构特征，研究其反应动力学、催化效率、热稳定性、机械稳定性和抗蛋白酶降解性等性能，探讨反应器类型、CLEAs填充方式和反应器的操控等因素对微球型CLEAs使用效率的影响，进而阐明微球型CLEAs的形成机理、构效关系和调控规律，建立一种构建CLEAs的新方法，制备出性能优异的微球型海藻糖合酶CLEAs，并获得其高效应用技术。预期成果对应用海藻糖合酶CLEAs低成本制取海藻糖、促进CLEAs技术在生物催化产业中的应用均具有重要意义。

交联酶聚集体（CLEAs）是一种无载体固定化酶，单位酶活高，溶剂耐受性强。现有方法（Sheldon法）是在溶液中制备CLEAs，所得CLEAs呈无定形的集簇状结构，粒径100μm以上的会产生明显的传质问题，粒径10μm以下的不便于分离重复使用，且分离时易损失。为解决上述问题，本项目以海藻糖合酶为模型酶，提出了一种用油包水乳液代替水溶液制备CLEAs的新方法。首先采用分段DNA shufflin并结合易错PCR，对筛选出的一株红色亚栖热菌的海藻糖合酶进行了改造，获得一株酶催化效率是野生型2倍的突变株，并优化了海藻糖合酶基因工程菌的高密度发酵条件。随后利用乳化法制备出微球型结构的海藻糖合酶CLEAs，利用扫描电镜、傅立叶红外光谱等技术手段，系统地研究了酶浓度、油种类、乳化剂种类及浓度、不同油水比、添加保护剂、Schiff碱还原处理及交联剂浓度等制备工艺因素对微球型CLEAs的结构及性能的影响规律，建立了较系统的微球型CLEAs的构建方法。与游离酶相比，微球型海藻糖合酶CLEAs的pH稳定范围从5～9拓宽到5～10，耐热性增强，更适于在较高温度下使用。此外，对Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe2+等金属离子和抑制剂Tris的抗性明显增强，对常用的蛋白变性剂尿素和盐酸胍也有相当的耐受性。与参照Sheldon法制备的CLEAs相比，乳化法制备的CLEAs外观呈较规则的微球形，粒径约20μm~60μm，易分离，活性高，重复使用性能更好。上述结果表明，乳化法是制备性能优异的CLEAs的一个新方法。该研究结果对促进CLEAs技术的发展以及应用无载体固定化酶低成本制取海藻糖均具有重要意义。