基于BRET原理的新型基因回路的构建与应用

Regulation of gene expression is of prime importance for a wide variety of basic and applied biological research areas including functional genomics, tissue engineering, gene therapy, and biopharmaceutical manufacturing. Molecular switches that are controlled by chemicals have evolved as central research instruments in mammalian cell biology. However, these tools are limited in terms of their precise control due to persistent gene expression resulted from difficult removal of chemical inducers. Although these limitations have recently been addressed by the development of optogenetic, the poor capacity for deep tissue penetration extremely affected future clinic translational research. Therefore, a novel genetic circuit with simple components, excellent induction characteristics, fast switching for deep tissue application is necessary. In this project, a novel genetic circuit based of BRET between luciferase and photosensitive protein would be developed according to the properties of luciferase and LightOn system through synthetic biology technology. The novel genetic circuit could accurately control transient or pulsed gene expression responded to light or luciferase substrates, which could engineer a technological infrastructure enabling the treatment of type 1 diabetes by oral administration of drug to inducing expression of insulin instead of the intraperitoneal injection of insulin in mice. This project may foster advances in basic biological research，such as gene expression regulation and gene functional exploration, and further provide a new strategy for type I diabetes therapy.

基因表达调控在功能基因组学、组织工程、基因治疗和生物制药等基础和应用生物学研究领域具有重要意义。化学诱导基因回路已经发展成为哺乳动物细胞生物学研究的重要工具。然而，由于化学诱导剂的难移除会导致基因持续表达，这些工具在精准调控方面受到了限制。虽然光诱导基因回路的发展解决了该限制，但光的深层组织穿透能力弱，影响了未来临床转化研究。因此，需要开发系统组分简单、诱导性质优良、能快速开关基因表达且可广泛用于活体深层组织的基因回路。本项目拟针对荧光素酶及LightOn系统的性质，结合合成生物学技术，基于荧光素酶与光敏蛋白间的BRET原理开发新型基因回路。该基因回路能通过光或荧光素酶底物来精准控制基因的短暂表达或脉冲式表达，可应用于口服药物诱导胰岛素表达替代腹部注射胰岛素来治疗I型糖尿病。本项目不仅将为基因表达调控、基因功能探索等生命科学基础研究提供技术支持和思路，还为I型糖尿病治疗提供了新的策略。

糖尿病是一种复杂的进行性疾病，其特征是慢性血糖浓度失控，目前全球至少有4.15亿人患有糖尿病。因此，一个能够实时监测糖代谢和工程控制细胞药物的技术平台将最大限度地挖掘具有诊疗精确性的生物医学潜力。在本项目支持下，通过将Nanoluc荧光素酶融合到光控转录因子GAVPO上，得到发光转录因子（luminGAVPO），构建成基于BRET原理的基因回路（LuminON）。luminGAVPO允许通过化学遗传学和光遗传学方法在哺乳动物细胞和小鼠中脉冲式的定量激活转基因表达。基因表达的脉冲幅度和持续时间都可以通过改变Nanoluc底物furimazine的量来调节。我们进一步证实了luminON基因回路可以维持1型糖尿病小鼠血糖稳态的能力。我们相信，基于BRET的LuminON基因回路具有转基因表达的脉冲式动力学，为生物系统的精确操作提供了高度敏感的工具，在未来的各种基础生物学研究以及基于基因和细胞的精确治疗中具有强大的应用潜力。在糖尿病治疗技术开发的基础上，进一步拓展糖尿病监测技术，开发并表征了一种超灵敏、高响应、比率型、遗传编码的乳酸探针（FiLa），使其能够监测活细胞和动物体内的乳酸波动。利用FiLa，我们证明了哺乳动物线粒体富含乳酸，并编制了亚细胞器乳酸代谢图谱，揭示了乳酸是感知各种代谢活动的关键枢纽。FiLa探针还可以直接成像1型（T1DM）和2型（T2DM）糖尿病小鼠乳酸水平的升高。因此，FiLa探针为定义健康和疾病中乳酸代谢的时空景观提供了强大且广泛适用的工具。因此，本项目在糖尿病监测与治疗上提供了前沿研究工具，对于功能基因组学、组织工程、基因治疗和生物制药等基础和应用生物学研究领域具有重要意义。