羊草低温相关未知功能基因的克隆与功能分析

低温冻害是农业生产中一种严重的自然灾害,抗冷基因的挖掘研究也一直是研究者所关注的热点。羊草是我国重要的乡土草资源，具有广泛的逆境适应能力，尤其能够在极端寒冷的环境中生存，挖掘羊草的抗冷基因资源具有十分重要意义。本项目在羊草对照和低温胁迫处理454转录本测序数据基础上，通过生物信息学分析筛选出低温胁迫处理下显著上调的"未知功能基因"序列，并采用RACE的方法获得1-2个基因全长cDNA。利用半定量PCR和Real time-PCR检测基因的组织特异性及低温胁迫下的表达模式；预测基因编码的蛋白质结构，进行原核表达、酵母表达后低温胁迫试验及蛋白的亚细胞定位，初步明确基因的生化功能；构建羊草表达载体进行羊草转化，验证目的基因的生物学功能。通过挖掘羊草低温有关优良基因资源，并对其功能进行分析，获得具有明确功能的基因，为小麦等重要作物的抗冷改良提供基因元件。

羊草作为禾本科多年生牧草，不仅耐旱、耐盐碱，而且耐极端低温。本研究基于实验室454 高通量测序数据，采用RACE 方法克隆得到三个羊草功能未知新基因，分别命名为LcSIN1，LcSIN2，LcFIN1。对羊草未知新基因功能进行研究，研究结果表明羊草新基因LcSAIN1，LcSIN2主要定位于细胞核；表达模式分析表明该基因受多种逆境胁迫诱导表达；过表达羊草新基因LcSAIN1，LcSIN2可提高转基因植物对盐胁迫的抗性，而抗盐性的提高主要是通过提高转基因植物体内可溶性物质的含量和盐胁迫相关基因的表达水平。LcFIN1基因受低温显著诱导表达，定位于细胞核中并具有转录激活特性；过表达羊草LcFIN1基因可显著增强转基因拟南芥的抗冻性。凝胶阻滞及染色质免疫共沉淀实验结果显示，LcCBF1 能与LcFIN1 的启动子区序列在体外进行结合，推测LcFIN1 在冷胁迫响应中所起作用是通过影响CBF 途径中相关基因的表达来实现。通过本研究得到具有明确功能的羊草抗性新基因，对于作物遗传改良具有积极的意义，为培育具有优异耐盐、抗冻性的作物品种提供了理想的候选基因。