应用翻译暂停理性重设计方法优化蓝藻抗病毒蛋白CVN的异源表达

Our previous work, published on Nature series journals, has discovered that translational pausing serves as important information for protein folding. Incorrect translational pausing sites can perturb the folding of proteins and thus impairing their biological functions. However, the experimental validation till now was limited on intrinsic E. coli proteins. It is not validated whether heterologous proteins expressed in E. coli still follow this law. In this study, we use Cyanovirin-N (CVN) as an example to validate the connection of translational pausing and heterologous protein folding. CVN has the activity inhibiting multiple viruses and is highly potential for medical applications. However it is hardly soluble when directly cloned and expressed E. coli, and thus impractical since decades. In this study, we apply translational pausing theory for the first time to rationally redesign the coding gene sequence of CVN aided by a novel algorithm, artificially manipulating its translational pausing sites to facilitate its folding, thus enhancing largely its soluble expression in E. coli to industrial production level. This study is expected to reveal the details of translational pausing and heterologous protein expression, establishing a novel and general optimization strategy using rational redesign of translational pausing.

我们前期发表在Nature系列杂志的研究成果表明，翻译暂停是指导蛋白质正确折叠的重要信息，不正确的翻译暂停位点将会干扰蛋白质的正常折叠与功能。但迄今为止对此理论的验证都局限在大肠杆菌内源蛋白。在大肠杆菌中表达的外源蛋白质是否也服从这一规律，目前尚无直接实验证据。本项目以来源于蓝藻的蓝藻抗病毒蛋白N（CVN）为例，验证其在大肠杆菌内异源表达时翻译暂停与折叠之间的关系。CVN具有广谱抗病毒活性，极具药用价值，但直接在大肠杆菌中克隆表达很难得到可溶性有功能的产物，多年来一直未能实用化。本研究首次应用翻译暂停理论，用计算机辅助设计算法对CVN的编码基因进行理性重设计，人工调整其翻译暂停以增强其折叠效率，大幅度提升CVN的可溶性表达量，达到生产实用水平。本研究的成果将揭示翻译暂停对外源蛋白质可溶性表达的规律，并建立全新、通用的翻译暂停理性重设计表达优化方法。

我们前期发表在Nature 系列杂志的翻译暂停理论表明，翻译暂停是指导蛋白质正确折叠的重要信息，不正确的翻译暂停位点将会干扰蛋白质的正常折叠与功能。但迄今为止对此理论的验证都局限在大肠杆菌内源蛋白。在大肠杆菌中表达的外源蛋白质是否也服从这一规律，目前尚无直接实验证据。本项目以来源于蓝藻的蓝藻抗病毒蛋白N（CVN）为例，验证其在大肠杆菌内异源表达时翻译暂停与折叠之间的关系。.我们发现，外源蛋白质在大肠杆菌内做异源表达时同样服从翻译暂停规律，没有合适的翻译暂停时其无法正确折叠，很难得到可溶性有功能的产物，这也是CVN多年来一直未能实用化的根本原因。本研究首次应用翻译暂停理论，用计算机辅助设计算法对CVN 的编码基因进行理性重设计，人工调整其翻译暂停以增强其折叠效率。改变其末端3-6个密码子，但不改变其氨基酸序列，在不改变发酵表达条件的前提下，将 CVN 的可溶性表达量提高2400倍，达到生产实用水平。与此同时，我们还发现，对于小型单结构域蛋白质，其末端翻译暂停也具有重要作用。这一发现是对我们之前提出的翻译暂停理论的进一步补充。这些结果，不但有着重要的理论意义，同时也为蛋白质工程提供了全新的视角，提供了现实可用的解决方案与工具，为大量药用和工业用蛋白质的规模化生产开辟新的道路。.本项目的执行过程中还产生了其他一系列翻译组研究相关的成果，例如世界上首次成功实现tRNA组特异性全定量测序、首次实现生理条件下所有基因的翻译速率测定，翻译组测序技术被人类蛋白质组计划列为核心支柱之一。共发表SCI论文8篇，获得3项国家发明专利。