伴生真菌协同兰科丝核菌促进兰花生长的细胞与分子机制

所有兰科植物依赖其菌根菌完成其生活史，因而菌根对于兰科植物保育和栽培具有重要意义。混合营养型绿色兰科植物的发现让我们必需重新认识兰科植物菌根的营养机理。前期研究我们发现，兰属植物菌根菌对宿主的促进效应依赖于伴生真菌的存在。在此基础上，本项目拟通过转录组测序和基因表达谱分析探讨兰花识别菌根菌和伴生真菌的信号路径以及伴生真菌协同兰科丝核菌促进兰花生长的分子机理；进一步对关键基因的时空表达模式进行分析获得与菌根形成和菌根效应相关的标记基因；系统观察宿主在形成菌根的不同时期其结构和亚细胞结构变化；分析伴生真菌对菌根菌生长及生理活性的影响以及两种菌在宿主根部的互作。在此基础上分析构架伴生真菌对菌根营养路径的调控机理。本研究有助于阐释植物与有益微生物互作的分子机理，拓宽人们对绿色兰科植物OM营养机理的认识，也为有效利用菌根菌促进绿色兰科植物生长发育打下基础。

所有兰科植物依赖其菌根真菌完成其生活史，因而菌根对于兰科植物保育和栽培具有重要意义。本项目从结构、生理以及分子等多个层面解析伴生真菌(MAF)协同兰花菌根菌（OMF）促进兰花生长的机制。取得的主要研究结果如下：.1..建立了基于RNA-seq测序及Trinity软件组装的兰花菌根、菌根真菌ML01以及伴生真菌ZH3A-3的参考转录组。该数据库的建立为解析菌根共生分子机理、检测菌根内各真菌定殖情况提供了重要基础数据平台。.2..数字基因表达谱分析表明：菌根形成诱导了宿主大量与植物次生代谢、激素合成、植物与微生物互作、植物营养转运等路径的基因差异表达；组合菌侵染诱导了宿主在RNA合成与降解、转录调控、不饱和脂肪酸合成及脂肪酸代谢、维生素代谢、营养转运、植物次生代谢、侧根形成等生理过程的特异基因表达。此外，菌根中也发现了与真菌细胞壁降解或变形以及营养转运相关的菌的基因。Real-time PCR分析证实了该数字基因表达谱的可靠性。.3..获得了与兰花菌根形成相关的三个候选标记基因：两个质子泵基因(CyHA1 和 CyHA2)和一个平衡核苷转运蛋白基因(CyENT3)。CyHA1 、CyHA2以及CyENT3的转录丰度均在OM菌根效应显著的15-20 dpi时达到峰值；CyENT3定位于细胞质膜上，且其转运活性依赖于质子泵驱动；CyENT3同源蛋白的功能为转运细胞分裂素和多种核苷类物质。据此我们认为CTK/IAA激素平衡以及质子泵活性调节对于兰花菌根共生体的形成及稳定发展有重要作用。.4..ML01和ZH3A-3接种均促进宿主质子外流，ML01单菌接种后宿主质子外流速度一直上升，组合菌接种15 天之后宿主的质子外流速度变慢，说明组合菌接种更有利于共生效应的持续发挥。该结果与前期菌根形成的分子响应分析相吻合，说明兰花菌根形成可以激活质子泵活性，从而促进宿主矿质营养吸收。.5..ML01和ZH3A-3在含有机氮的培养基中均产生活性IAA，并对植物IAA信号路径和转运相关基因的表达产生影响。该结果表明，生长素信号和代谢路径在兰花菌根形成与发挥共生效应方面起调控作用。.6..ML01与大花蕙兰形成典型的菌丝结结构，并通过菌丝结消解方式为宿主提供营养；而油脂含量占总干重40%以上的ZH3A-3则主要通过菌丝裂解的方式为宿主提供营养物质或活性成分。