叶酸对HPV16整合关键基因E2及其结合位点甲基化的调控在宫颈癌变进展中的作用

Cervical cancer is the fourth cancer among women over the world. High risk human papillomavirus is the crucial cause of the cervical noeplastic progression，and HPV integrate into the host genome is the key point, but the mechanism is not precisely clear. The effect of Low folate status and HPV methylation in cervical noeplastic progression cannot be ignored, and there are relationships between them. Base on that folate have regulatory function in methylation, we hypothesize folate may involve in the development of cervical cancer through regulating the key integrated gene of HPV16. In order to confirm this hypothesis, normal cervix, CIN and SCC women will be selected. Based on folate level of serum and erythrocyte , we will detect the methylation level in key integrated gene E2 and E2 binding sites (E2BSs) of HPV16 by pyrosequencing , filter the different methylation of CG points, and analysis HPV16 physical status, expression of integrated gene (E2) and oncogene (E6, E7) , in order to analysis association among these biological event. While cervical cancer cell lines SiHa、Caski and cervical keratinocyte cell line W12 are intervened by folate and demethylation reagent（5-Aza-dc）, to verify the result obtained from population study. This study aims to evaluate the effects and possible molecular biology mechanisms of folate through regulating the methylation status of key integrated gene E2 and its binging sites (E2BSs) of HPV16 in the cervical noeplastic progression. So may provide evidences for etology and pathogenesis of cervical cancer and afford novel insights into the cancer management.

宫颈癌是全球女性第四大肿瘤，高危型HPV感染是宫颈癌变进展的必要病因，HPV与宿主DNA整合是关键环节，但机制不明。鉴于叶酸缺乏和HPV甲基化在宫颈癌变过程中均有重要作用，且存在内在生物学关联，提示叶酸可通过调控HPV16整合关键基因的甲基化而影响宫颈癌变进展。为验证此假设，本研究拟选择不同宫颈病变妇女为研究对象，在分析机体血清和红细胞叶酸水平的基础上，应用焦磷酸测序检测并筛选HPV16整合关键基因E2及其结合位点E2BSs的甲基化水平差异位点，并结合HPV16 E2与效应基因E6的DNA拷贝数判断HPV16的整合状态，进而分析上述事件的内在关联。同时选择不同整合状态的宫颈癌及癌前病变细胞株（SiHa、Caski、W12）进行叶酸和去甲基化双干预实验，进一步加以验证。依此综合评价叶酸对HPV16 E2、E2BSs甲基化的调控及其在宫颈癌变进展中的作用，为宫颈癌变发病机制的研究提供新的证据。

人乳头瘤病毒（HPV），特别是高危型HPV16持续感染是宫颈癌发生最主要的病因因素，HPV16与宿主基因整合宫颈癌变的关键，但机制不明。鉴于叶酸缺乏和HPV甲基化在宫颈癌变过程中均有重要作用，且存在内在生物学关联，提示叶酸可通过调控HPV16整合关键基因的甲基化而影响宫颈癌变进展。本研究在综合分析机体叶酸水平的基础上，采用重亚硫酸盐处理后测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测HPV16整合关键基因E2结合位点E2BSs的甲基化水平，并结合HPV16 E2与效应基因E6的DNA和蛋白相对表达量判断HPV16的整合状态。同时选择不同整合状态的宫颈癌细胞株（SiHa、Caski、C33A）进行叶酸和去甲基化双干预实验，依此综合评价叶酸对HPV16整合关键基因E2结合位点E2BSs甲基化的调控及其在宫颈癌变进展中的作用。结果显示，HPV感染，尤其是HPV16感染是宫颈癌变发生的危险因素，HPV16关键整合基因之间存在相互关联，HPV16 E6蛋白高表达、 HPV16 E2蛋白低表达、E2/E6蛋白的比值降低，均预示着HPV整合程度升高，宫颈癌变的风险增加。随着宫颈病变程度加重，HPV16 E2结合位点E2BSs区甲基化率逐渐升高，尤其是E2BS3和E2BS4区甲基化水平与宫颈病变进展具有相关性，补充叶酸或抑制甲基化水平后，可抑制宫颈癌细胞的增殖，促进凋亡，且HPV甲基化水平下降，癌基因表达下降，提示HPV整合关键基因甲基化在调节病毒表达中发挥重要作用。机体叶酸水平降低可增加宫颈癌变的罹患风险，且与HPV16感染具有正相加交互效应；叶酸水平与HPV16 E2结合位点E2BSs区甲基化呈现负相关，低叶酸水平可增加HPV癌基因的甲基化水平，但本次未在体外细胞试验中发现叶酸对HPV癌基因甲基化水平的影响，有待深入研究。本研究为预测宫颈病变的进展和风险评估，深入研究其生物学机制以及寻找干预靶点提供了重要科学依据。