利用愈伤组织转绿技术与TALEN技术建立水稻高效叶绿体转化系统的研究

Chloroplast transformation technology has become a valuable tool for the creation and cultivation of plants, especially for dicotyledons, and chloroplasts offer a viable alternative to conventional bioreactor systems. Tobacco has been the most extensively used plant for chloroplast transformation, mostly because leaf blades were served as target tissues which contained a large number of mature chloroplasts, and the ability to obtain homoplastomic plants via subsequent rounds of regeneration using leaves as explants. The major obstacle to the extension of chloroplast transformation technology to monocotyledonous cereal crop such as rice is that the proplastids rather than chloroplasts existed in the rice callus, a nearly exclusively explant for the rice regeneration in tissue culture. In order to overcome the barriers of rice chloroplast transformation existed in the tissue culture, in this project, we will study the tissue culture technologies related to callus greening of rice, and use the method of TALEN system combined with homologous recombination to improve integration efficiency of foreign gene to chloroplast genome. The establishment of effective chloroplast transformation in rice provides theoretical basis for hybrid rice breeding and improvement of photosynthetic efficiency of rice.

叶绿体转化技术在农业育种或医药领域具有独特的优越性和广阔的应用前景。烟草等双子叶植物叶绿体转化系统之所以成熟的一个重要原因是这些植物可利用绿色叶片或绿色愈伤组织作为受体，外源基因导入成熟叶绿体比较容易，而且在筛选过程中可以依赖于绿色组织反复再生获得同质化植株。然而水稻愈伤组织中的前质体还未发育成叶绿体，且水稻叶片再生较难，这些限制是建立稳定的水稻叶绿体转化系统的主要障碍。本研究目的是对水稻愈伤组织绿化组培技术进行研究，克服水稻愈伤组织不含成熟叶绿体带来的障碍，以及利用TALEN定点敲除系统对叶绿体基因组定点断开，再用同源重组方法将外源基因定点整合至叶绿体基因组断点处，从而完善提高同源重组效率的技术手段。拟通过基因枪转化，以绿色愈伤组织为靶目标，利用现代分子遗传学手段分析转化植株，建立新型的水稻叶绿体转化系统，为创新水稻育种材料和提高水稻光合效率途径提供理论依据。

叶绿体转化技术在农业育种和生物医药等众多领域具有独特的优越性和广阔的应用前景。目前该技术在双子叶植物中较为成熟，而在单子叶植物中尚未能取得突破性进展。因此，对具有重要粮食安全战略地位的单子叶农作物水稻进行叶绿体转化技术的研究具有重要的意义。前期利用潮霉素抗性基因（hpt 基因）作为标记基因，通过构建含有hpt 和EGFP 基因的双顺反子叶绿体表达载体pCTE04，经基因枪轰击和组织培养筛选，获得了少量转化株。Southern blot 证实有外源片段整合到叶绿体基因组的相应位点，初步建立了水稻的叶绿体转化体系。但是转化效率低下，主要表现转化植株叶片中的荧光表达量少，以及愈伤组织成活率和成苗率低。在此基础上，选择了水稻品种9311叶绿体基因组中的trnA-trnI间隔序列作为参考序列，设计靶位点，基于TALEN和CRISPR/Cas原理分别构建了相关的水稻叶绿体基因组定点编辑载体pCE4-IALR和pC1304-Cas9-sgRNA。经过大肠杆菌原核系统检测，可以明显观察到荧光、潮霉素抗性和FokI蛋白、Cas9蛋白等载体相关元件的正常表达，说明构建的水稻叶绿体基因组TALEN和CRISPR/Cas定点编辑载体在原核系统中具有正常的功能。同时，优化了愈伤组织再分化的培养条件，得到了以IBA和TDZ为组合的最优培养条件。将构建的水稻叶绿体基因组TALEN载体pCE4-IALR与叶绿体表达载体pCTE04用基因枪法共转化绿化后的愈伤组织，得到了一些转化植株。经PCR检测和统计分析，发现TALEN与同源重组相结合的方式能够一定程度地提高水稻叶绿体转化频率，为后续禾本科植物的叶绿体转化技术研究提供了一个新思路。