非天然构象H-AChR亚单位激活B细胞诱导眼肌型重症肌无力的机制研究

Most Myasthenia gravis (MG) patients first have ocular symptoms and later develop generalized MG(gMG). The reasons behind the pathogenic mechanisms of ocular MG（oMG） and progression of oMG to gMG are largely unknown. This project is based on our previous findings that oMG was induced by the immunization of recombinant H-AChR subunit, and the insight of different roles of B cell in oMG and gMG pathogenic mechanisms. We hypothesize that oMG initiates and develops predominantly as a result of B cell mediated immunity to non-conformational AChR subunits, and then progresses to gMG and development of oMG symptoms does not necessarily require T helper cell functions. To provide evidence for this hypothesis, we are planning to compare profiles of antibody and B cell related immunological factors among ocular vs generalized MG patients and EAMG mice. Secondly, we will dynamically study the processes of oMG progression to gMG and see which B cell parameters are changing most in relation with clinical scores and antibody levels. We will clarify the critical roles of the underlying immunological mechanisms predominantly mediated by B cell mediated immunity to non-conformational H-AChR subunits，which will bring forward innovation of treatment methods to control oMG or to prevent the progression from oMG to gMG.

重症肌无力（MG）患者多以眼部表现为首发症状并可能逐渐发展为全身型肌无力（gMG），眼肌型MG(oMG)的触发机制以及oMG 和gMG之间的内在联系仍值得探讨。本项目以我们的前期发现"重组H-AChR亚单位诱导oMG的发生"为切入点，从B细胞在oMG 和gMG发病中所扮演角色入手，提出oMG的发生并进展为gMG的可能机制：非天然构象H-AChR亚单位激活B细胞诱导oMG的发生，oMG进一步可能进展为gMG，Th细胞在oMG的触发过程中可能并非必要因素。本项目拟通过探讨oMG和gMG患者、oEAMG和gEAMG小鼠抗体和B细胞相关免疫学因素差异，同时动态观察oMG向gMG转变过程中小鼠临床症状、抗体水平改变与B细胞相关免疫学因素变化的内在联系，阐明非天然构象H-AChR亚单位激活B细胞介导为主的应答机制在oMG发生发展中的作用，为oMG的早期防治提供新的思路。

眼肌型重症肌无力（ocular myasthenia gravis, oMG）起病隐匿、症状较轻，但可在短时间内向全身型MG（generalized MG, gMG）进展，其机制迄今未明。本项目在前期研究发现“非天然构象H-AChR亚单位激活B细胞诱导oMG的发生”基础上，进一步探讨B细胞在oMG向gMG进展过程中可能的作用机制。我们收集并分析了oMG、gMG患者组与对照组外周血中抗体及B细胞相关免疫学指标，发现oMG组和gMG组中AChR-Ab和AChR α-Ab水平均较对照组明显升高，且gMG组中AChR-Ab水平较oMG组中显著升高。同时，我们对oMG组、gMG组及对照组外周血淋巴细胞行体外培养，并给予不同浓度H-AChR α亚单位和完整H-AChR分子抗原刺激，发现其淋巴细胞的增殖反应随着H-AChR α亚单位刺激抗原的浓度增高而增大。此外，我们还发现oMG组和gMG组外周血中滤泡B细胞（CD19+CD23+CD35+）、记忆B细胞（CD19+CD27+CD44hi）显著高于对照组，且oMG组滤泡B细胞比例显著高于gMG，而记忆B细胞比例显著低于gMG组，提示oMG向gMG进展的过程中B细胞参与并发挥了重要作用。另一方面，我们利用非天然构象H-AChR亚单位免疫HLA转基因小鼠构建眼肌型实验性自身免疫性重症肌无力(ocular experimental autoimmune MG, oEAMG)模型和gEAMG模型，发现oEAMG和gEAMG小鼠体内AChR-Ab水平均较对照组显著升高，且在眼外肌和骨骼肌样本神经肌肉接头处中亦发现明显IgG1，IgG2b 及IgM沉积；同时，oEAMG和gEAMG小鼠脾脏中记忆B细胞和激活细胞（CD19+CD44hi）比例明显高于对照组，但oEAMG小鼠脾脏记忆B细胞比例明显低于gEAMG小鼠；也进一步佐证了B细胞在oMG进展过程中起到重要作用。另外，我们利用非天然构象H-AChR ε亚单位免疫HLA-DR3转基因小鼠成功建立oEAMG模型，提示非天然构象H-AChR亚单位为oMG始动因素，且不同H-AChR亚单位和某一特定的HLA分子的交互作用诱导的自身免疫反应可能导致oMG的发生。综上所述，本项目揭示了非天然构象AChR亚单位诱导的B细胞介导为主的免疫应答机制在oMG发生发展过程中的作用，为后续研究奠定了基础。