在肿瘤细胞中E2F1调控NFκB/IKKα/IKKβ表达的机制研究

It is the importent event that HDAC up regulates the expression of SURVIVIN and prevents the cell apoptosis in the early stage of tumoregenesis, which help us to open the windows for interving by HDACI. Unfortunately, whethere it rely on the mechanism that E2F1 working as a target of HDAC, and which might work as the repressor on the promoters of NFκB/IKKα/IKKβ genes is stil unknow. This project is based upon that HDACI was able to increase the expression of E2F1,and decrease that of Survivin,IKKa and IKKβ; NFκB/IKKα/IKKβis the partner with Survivin to surprise the apoptosis. So,it is our propose that E2F1 may work as an inhibition protein to suprise NFκB/IKKα/IKKβpathway through binding to the promotors of these genes. We are going to test this hypothesis by using the methods of HDACI and ChiP. The new finding of molecular regulation will creat the fresh targets for anti-tumor medicines.

组蛋白去乙酰化酶调控凋亡抑制基因Survivin的表达、参与早期肿瘤发生发展是一个重要的事件，但其是否在转录水平通过对E2F1的干预，调控NFκB/IKKα/IKKβ信息通路及Survivin表达的分子机制尚不清楚。立项依据包括：使用HDACI可以增强E2F1的转录活性、诱导肿瘤细胞死亡；NFκB信息通路是与Survivin共同表达增高的参与调控细胞凋亡的因素之一。因此，在HDACI诱导的肿瘤细胞凋亡过程中，是否存在E2F1通过抑制NFκB/IKKα/IKKβ基因的表达、减弱survivin的功能的调控途径？项目计划通过干扰HDAC的活性，应用实时定量PCR等方法检测HDAC、E2F1、NFκB信息通路、Survivin基因的表达变化及对细胞凋亡的影响，确定它们的相互关系；应用ChiP方法确定E2F1对NFκB信息通路基因表达的调控关系。这将为临床药物干预提供新的靶点。

目的：SURVIVIN基因在肿瘤组织中持续高表达的分子机制未见报道；转录因子E2F1是否参与了IKK/IKKβ/NFκB信号通路的表达调控，是否通过该信号通路进一步参与了对SURVIVIN的表达调控，目前尚没有研究资料。方法：在食管鳞状细胞癌细胞株中，利用E2F1的抑制剂抑制其转录水平的表达，建立E2F1的过表达及shRNA质粒载体，转染食管鳞状细胞癌细胞株，采用qPCR及Western-blot，了解E2F1与IKKα/IKKβ/NFκB/SURVIVIN信号通路在转录水平及蛋白水平的表达调控关系。流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡。应用ChIP实验分离E2F1蛋白在IKK、IKKβ、NFκB基因启动子区有无结合位点。双萤光素酶报告基因方法进一步验证E2F1蛋白在IKK、IKKβ、NFκB基因启动子区上有无结合位点。结果：在食管癌细胞株ECA109、KYSE150中，使用E2F1抑制剂BZB，干预24小时及48小时，E2F1在转录水平及蛋白水平的抑制同时，伴有IKKβ/NFκB/SURVIVIN在转录及蛋白水平的表达抑制。E2F1过表达质粒载体转染后，细胞株E2F1转录及蛋白水平表达均增高，伴有IKKβ、NFκB、SURVIVIN在转录及蛋白水平表达的增高。shRNA质粒转染后，E2F1在转录及蛋白水平的表达均降低，伴有IKKβ、NFκB、SURVIVIN在转录及蛋白水平的表达下调。细胞周期及细胞凋亡检测提示，E2F1在两种细胞株中有促进G1/S期转换，细胞增值的作用，S期细胞比例明显增高。当E2F1基因被E2F1shRNA基因沉默后，促进细胞增值的功能受到明显抑制，S期细胞比例明显降低，凋亡早期细胞明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。染色质免疫共沉淀实验证实在ECA109细胞株中E2F1蛋白在IKKβ基因启动子区可能有结合位点。双萤光素酶报告基因实验再证实共转染pGV142-E2F1，pGL3-IKKβ，pRL-TK组萤光素酶的活性明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：在ECA109及KYSE150细胞株中，E2F1与SURVIVIN存在表达调控关系，其机制可能是通过了IKKβ/NFκB经典信号通路。在ECA109细胞株中，E2F1蛋白可能通过结合IKKβ的启动子区-751bp以内，参与调控NFκB、SURVIVIN的表达。