低强度超声促进卡铂治疗舌癌效应的机制研究

Low-intensity ultrasound in combination with chemotherapy drugs is a novel cancer treatment, this combination therapy has become a research hotspot to treat malignant tumors in recent years. As epithelial tumors, squamous cell carcinoma of the tongue is an ideal model for this combination therapy approach. Carboplatin is tongue squamous cell frontline chemotherapy drugs. Our previous studies have shown that low-intensity ultrasound in combination with carboplatin can enhance the anti-tongue effectiveness of carboplatin, but its mechanism is not clear. The purpose of this project is to explore the internal mechanism of low-intensity ultrasound in combination with carboplatin produce synergistic effects. This topic intends to explore from the following aspects: 1. By detecting the state of cellular DNA synthesis, to verify whether low-intensity ultrasound play a synergistic effect is by enhancing the destruction of carboplatin on DNA molecules. 2. Clarify the role of the physical effects of low-intensity ultrasound generated through observe the effect of ultrasound on the cell membrane and cytoskeleton hole. 3. Explore the signaling pathways for promoting apoptosis. 4. Expound the combination therapy induced upstream mechanisms by detecting the changes of critical molecule in PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Low-intensity ultrasound in combination with chemotherapy drugs provided a way to reduce chemotherapy drug side effects and enhance therapy effect of cancer, which will provide a new treatment modality in clinical treatment of malignant tumors.

低强度超声协同化疗药物的联合治疗是一种新型的肿瘤治疗手段，近年来成为治疗恶性肿瘤的研究热点。舌鳞癌为上皮性肿瘤，是这种联合治疗方式的理想模型。卡铂是舌鳞癌的一线化疗药物。我们的前期研究显示低强度超声联合卡铂可增强卡铂的抗舌癌效能，但其机制还不明确。本项目目的是探讨低强度超声联合卡铂产生增效效应的可能机制。本课题拟从以下几方面进行探索：1.检测细胞DNA合成状态，验证低强度超声是否是通过增强卡铂对DNA分子的破坏而发挥增效作用；2.观察超声对细胞膜孔和细胞骨架的影响，阐明低强度超声产生的生物学效应在联合增效中的作用；3.探讨联合治疗促凋亡的外源性信号通路；4.检测PI3K-Akt-mTOR信号通路中关键分子的变化，阐述联合治疗诱导增效的上游机制。低强度超声协同化疗药物的联合治疗提供了一条在增强肿瘤化疗效应的前提下降低药物毒副作用的途径，这将为临床治疗恶性肿瘤提供新的治疗模式。

本项目采用低强度超声（LIUS）协同化疗药物的新型肿瘤治疗手段，应用由哈尔滨工业大学凝聚态科学与技术研究所自主研发的低强度超声治疗仪联合舌鳞癌的临床一线化疗药物卡铂（CBP）对金黄地鼠原位舌癌和多种舌鳞癌细胞进行治疗。首先应用DMBA涂抹建立金黄地鼠原位舌癌模型，利用免疫组化和Western blotting等方法，在动物体内观察CBP联合LIUS治疗产生的协同抗癌作用。结果显示，LIUS联合CBP可增强CBP对肿瘤生长的抑制作用，延长了动物的生存期，且不增加副作用的发生率。检测肿瘤细胞DNA合成状态，发现联合处理增强了CBP对细胞DNA的固有损伤，抑制了DNA修复蛋白MGMT和Chk1的表达，并增加了DNA损伤诱导蛋白GADD45α的表达，同时诱导细胞凋亡。使用低强度超声处理舌癌细胞，通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜检测肿瘤细胞的形态变化和不同超声强度及作用时间下, 人舌癌细胞细胞膜表面及其内部超微结构的动态变化，发现LIUS可导致细胞表面形成孔隙，且随着US强度的增加细胞表面孔隙的直径逐渐增大，当超声强度增加到4W/cm2时，孔隙直径可达6 μm；此外我们发现1W/cm2的超声处理细胞后即刻产生孔隙，而孵育至18 h，在SEM下就观察不到孔隙的存在。接着我们应用荧光显微镜和HPLC检测细胞内的药物含量，发现低强度超声可增加肿瘤细胞对药物的吸收达3-7倍；这个实验结果表明超声对细胞超微结构的影响在联合处理产生增效效应中发挥了重要作用。LIUS联合CBP增强的CBP对细胞增殖、侵袭和迁移能力的抑制，诱导细胞凋亡；免疫荧光染色和蛋白质印迹分析实验显示超声处理后内源性自噬相关蛋白表达增多，提示自噬性细胞死亡通路可能参与了LIUS联合CBP处理诱导细胞凋亡的发生。动物实验结果和体外结果都显示，联合处理后肿瘤细胞DNA损伤增加，此结果支持低强度超声是通过增强卡铂对DNA分子的破坏而发挥增效作用的理论。低强度超声增强了CBP对肿瘤细胞DNA的损伤，进一步研究发现P53及其上、下游调控因子Chk1、GADD45α、MDM2在诱导DNA损伤中发挥了重要作用，P38/JNK信号通路可能参与了联合治疗诱导增效的上游机制。本项目结果表明，表明LIUS联合化疗药物的治疗模式可能为临床肿瘤患者的治疗带来益处。