Raf1激酶抑制蛋白RKIP与配体的复合物溶液结构和功能研究

Raf1 kinase inhibitor protein RKIP is an important regulator in MAPK and GPCR signal pathways. Recent studies show that RKIP is closely related with many diseases. Therefore, exploring inhibitors and agonists of RKIP will help to design and develop new anti-tumour drugs against the RKIP target. Our previous studies demonstrate that, RKIP can adaopt feasible conformation to bind either Raf1 or Grk2 kinase, and regulate MAPK and GPCR signal pathways. Based on the structural characteristics of the ligand-binding pocket of RKIP , we screened out four ligands (Suramin, Cefotetan, Clofazimine, Pranlukast) from the drug library, and determined their binding affinites for RKIP with bio-layer interference technology. Furthermore, we will determine the solution structures and dynamics of the complexes of RKIP with these ligands, and address the intervention role of these ligands on the interactions of RKIP with Raf1 and Grk2 kinases, and then elucidate the structural basis for these ligands regulating MAPK and GPCR signaling pathways. Our results will be helpful for designing and developing novel drugs for treating RKIP related diseases.

Raf1激酶抑制蛋白 RKIP是MAPK和GPCR细胞信号通路的重要调控蛋白。近年来研究表明RKIP与许多肿瘤相关，研究RKIP的抑制剂和激动剂，有助于设计和研发以RKIP为靶点的抗肿瘤新药。我们的前期工作表明：RKIP通过改变配体结合口袋的构象，改变RKIP与Raf1， Grk2 激酶的相互作用，从而调控MAPK和GPCR信号通路。本项目以RKIP的配体结合口袋为活性中心，从药物库里筛选出并用生物薄膜干涉技术验证了四种与RKIP具有高亲和力的配体（Suramin, Cefotetan, Clofazimine, Pranlukast）,进一步用核磁共振技术研究 RKIP与这四种配体的复合物结构和动力学，以及这些配体对RKIP与Raf1, Grk2相互作用的干扰，揭示这些配体调控MAPK和 GPCR信号通路的结构基础和分子机制，为设计和研发用于治疗与RKIP相关疾病的药物提供理论依据。

Raf1激酶抑制蛋白RKIP是细胞内MAPK（Ras/Raf1/MEK/ ERK）信号通路的重要调控蛋白。MAPK细胞信号通路的失调与许多肿瘤的发生密切相关。因此，研究RKIP蛋白的抑制剂或者激动剂，有助于设计和研发以RKIP为靶点的新的肿瘤药物。本项目以RKIP的配体结合口袋为靶点，通过计算机虚拟筛选，从现有药物分子库里筛选并验证出四种与RKIP具有高亲和力的配体（Suramin，Cefotetan，Clofazimine，Pranlukast）。BLI实验表明，这四种配体与RKIP具有较强的结合力，Kd值分别为：24 µM (Suramin)，36 µM (Cefotetan)，93 µM (Clofazimine) 和106 µM (Pranlukast)，比RKIP与天然底物（Kd，8.8 mM）结合强度要高出几十倍到几百倍，也比RKIP与Raf11-147激酶（Kd，281 µM）的结合强度高出几倍到几十倍。NMR 实验和ITC实验表明，Suramin，Cefotetan，Clofazimine，Pranlukast这四种配体主要结合在RKIP的配体结合口袋上，使得RKIP没有足够的蛋白面结合Raf1蛋白。细胞生物学实验表明，这四种配体对RKIP介导的MAPK信号通路都有调控作用。160 μM Suramin可以 提高下游ERK激酶的磷酸化水平2倍多, 80 μM Cefotetan，可以提高ERK激酶的磷酸化水平约4倍多。25 μM Pranlukast可以使细胞内的p-ERK水平提高约17.1 %；3.2 μM Clofazimine 可以使细胞内的p-ERK水平提高约36.9 %。总之，我们不仅获得了Suramin，Cefotetan，Pranlukast， Clofazimine 这四种配体调控MAPK信号通路的结构基础，而且也为治疗RKIP相关疾病的药物的改造及新药的筛选提供了理论依据。