核小体组装蛋白Nap1和组蛋白复合物的结构与功能研究

The nucleosome assembly is an essential process for maintaining genome stability and passing genetic information. Histone chaperones plays a central role in nucleosome assembly by mediating histone recognition, selection, and transfer,etc. Aberration in histone chaperone causes a number of human diseases including cancer. The highly conserved Nap1 (Nucleosome Assembly Protein 1) is a major chaperone protein for H2A-H2B histone. During past 30 years, studies on Nap1 reveal its numerous functions in DNA replication, cell proliferation, and embryo development, etc. However, the underlying mechanism by which Nap1 recognizes H2A-H2B and modulates nucleosome assembly/disassembly still remains elusive. In this study, we are going to determine the high resolution structure of Nap1-H2A-H2B complex via X-ray crystallography, and gain insight into Nap1-mediated nucleosome assembly/disassembly. In the past two years, we determined a number of structures of histone chaperone complex and identified their distinct modes for histone recognition. Moreover, we obtained the diffraction data by using the crystalized Nap1-H2A-H2B complex and established multiple in vivo or in vitro approaches for Nap1 function analysis. The study will not only identify the Nap1 recognition mode for H2A-H2B, but also reveal the mechanism by which Nap1 modulates nucleosome assembly/disassembly. It will broaden our understanding of the cause of diseases associated with histone chaperon aberration.

核小体的正确组装是细胞准确传递遗传信息的基础。组蛋白伴侣蛋白参与组蛋白的识别、筛选、转运，在核小体组装中发挥重要功能，其异常往往导致包括癌症在内的多种疾病。核小体组装蛋白Nap1是组蛋白H2A-H2B的伴侣蛋白，其序列高度保守。Nap1在DNA复制、细胞增殖、胚胎发育等生命活动中发挥了重要作用。Nap1识别H2A-H2B的机制是困扰科学界多年的难题，本研究拟通过X射线晶体学方法测定Nap1-H2A-H2B复合物的三维结构并研究其介导核小体组装的分子机制。申请人所在课题组在组蛋白伴侣复合物研究领域具有丰富经验，近年来先后解析了多个组蛋白伴侣复合物结构并阐明了相应的分子机理。目前Nap1和组蛋白复合物较高分辨率晶体衍射数据的收集及多个功能分析系统的建立已经完成。本研究将通过揭示Nap1识别H2A-H2B的结构基础阐明其介导核小体组装的分子机制，并为组蛋白伴侣异常相关疾病发生机理的研究提供线索。

真核生物中，核小体的组装与去组装对于DNA的复制、转录,基因的表达，细胞的增殖与分化等诸多生命过程有着重要影响。而组蛋白伴侣在核小体组装过程中发挥着重要调控作用，对人类疾病的发生发展也有着多方面的影响。Nap1（Nucleosome Assembly Protein 1）是一个经典组蛋白伴侣，参与了多个重要生命过程，并且从酵母到动物和植物中都十分保守，然而经过了三十多年的研究，Nap1识别组蛋白H2A-H2B的分子机制却一直存在争议。. 本项目中我们解析了2.3 Å的酿酒酵母Nap1核心区域（yNap1 69-370）与全长组蛋白H2A-H2B形成的复合物晶体结构。在复合物结构中，每一个yNap1二聚体形成一个耳机状结构，与组蛋白H2A-H2B形成2:1比例的复合物。而进一步的晶体学对称性分析后我们首次发现，两个yNap1二聚体与两个H2A-H2B形成了4:2结合比例的相互交叉的“击掌状”（clapping hands）高聚结构，并且我们通过体外交联和分子筛-静态光散射分析（SEC-MALS）等实验方法验证了这一复合物聚集形式。. 我们还通过体外竞争性pull down等实验鉴定出yNap1α4-α6螺旋残基E194是yNap1与组蛋白结合的关键氨基酸，并且这一结合位点同时受到yNap1 CTAD结构域即酸性C terminal 的影响。我们通过一系列生化实验还证明yNap1 CTAD和yNap1 β5-β6结构域可以调控yNap1-H2A-H2B复合物的聚合状态。. 综上所述，本项目首次解析了Nap1-H2A-H2B复合物的高分辨率晶体结构,提出了Nap14-(H2A-H2B)2的分子结构模型，揭示了Nap1识别组蛋白H2A-H2B的关键氨基酸位点，并阐明了Nap1采用合作的双位点结合模式与H2A-H2B相互作用的分子机制，为Nap1这一重要组蛋白伴侣的功能研究奠定了坚实的基础，为相关疾病的研究提供了结构依据。