米曲霉鞘糖脂应答温度胁迫的分子机理研究

A. oryzae still shows great adaptability outside the optimal growth temperature, while the molecular mechanism of A. oryzae in response to temperature stress is still unclear. Glycosphingolipids (GSLs) are key components of plasma membrane and their contents directly affect the membrane integrity and permeability. GSLs can reduce the membrane permeability to enhance the membrane stability in response to cold, high temperature or other adversity. In the previous study, we found that most of the A. oryzae GSLs synthesis genes show opposite expression levels in response to low temperature and high temperature, interestingly, the GSLs accumulation also has an opposite trend as genes. It is speculated that there might be different molecular mechanism of A. oryzae GSLs in response to low temperature and high temperature. Therefore, using bioinformatics combined with molecular biology to elucidate the molecular mechanism of A. oryzae GSLs under temperature stress, changing the synthesis of GSLs to improve the ability of A. oryzae in respond to temperature stress is a research topic. In this study, A. oryzae 3.042 was used as the research object, and the key genes of GSLs synthesis in response to temperature stress were used as the breakthrough point to confirm the significant effect of GSLs in A. oryzae under temperature stress. Our study provides a genetic source for the development of industrial strains resistant to low temperature and high temperature, and also provides a research idea for studying the molecular mechanism of other filamentous fungi in response to temperature stress.

米曲霉在最适生长温度外仍然可以很好的生长和/或发酵，表现出极强的适应性，但目前对米曲霉应答温度胁迫的分子机制尚不明确。鞘糖脂是质膜的关键组分，其含量直接影响细胞膜完整性和通透性。当细胞处于寒冷、高温或极端环境时，鞘糖脂能降低膜的渗透性，有利于增强质膜的稳定性。前期研究中，我们发现绝大部分米曲霉鞘糖脂合成基因在应答低温和高温的表达水平相反，且鞘糖脂积累量也呈相反趋势，推测鞘糖脂应答低温和高温的分子机制可能不同。因此，利用生物信息学结合分子生物学阐明米曲霉鞘糖脂应答温度胁迫的分子机制，改变鞘糖脂合成是提高米曲霉应答温度胁迫能力的一个研究方向。本研究以米曲霉泸酿3.042为研究对象，以响应温度胁迫的鞘糖脂合成关键基因为切入点，证实鞘糖脂在米曲霉应答温度胁迫中的显著作用，揭示鞘糖脂应答温度胁迫的分子机制，为开发耐低温、耐高温的工业菌株提供基因源，也为研究其他丝状真菌应答温度胁迫机制提供研究思路。

米曲霉在最适生长温度外仍然可以很好的生长和发酵，表现出极强的适应性，但目前对米曲霉应答温度胁迫的分子机制尚不明确。因此本研究对不同温度培养下的米曲霉进行了转录组和脂质组关联分析，通过生物信息学结合分子生物学和遗传转化对强烈应答温度胁迫的鞘糖脂合成关键基因进行了功能验证。首先，本研究通过施加外源鞘糖脂和鞘糖脂合成抑制剂的实验，证实了鞘糖脂在米曲霉应答温度胁迫中的显著作用。其次，完成了不同温度条件下米曲霉转录组与脂质组的关联分析，发现大量差异表达基因（DEGs）聚集在脂质和糖代谢途经，重点分析了温度胁迫下的鞘糖脂合成途经，通过生物信息学鉴定了31个米曲霉鞘糖脂合成基因，分析了它们在不同温度胁迫下的表达水平，有9个鞘糖脂合成关键基因在高温胁迫下显著上调，并伴随着中性鞘糖脂含量的增加。另外，与中性鞘糖脂合成正相关的不饱和脂肪酸，如α-亚麻酸和亚油酸在高温下大量积累，与中性鞘糖脂含量增加的结果相一致。最后，转录组表达水平分析结合qRT-PCR验证，筛选到13个可能与温度胁迫相关的鞘糖脂合成关键基因，并对其进行了过表达和RNAi/敲除的研究。其中，抑制酸性鞘糖脂（IPC）合成关键基因AoAur1表达的RNAi-AoAur1菌株生长速度更快，菌丝融合频率更高，对高温的耐受性也更强；转录组和脂质代谢分析发现，RNAi-AoAur1菌株中与IPC合成相关的基因表达水平明显下调，IPC积累量比对照菌株低；相反，参与中性鞘糖脂合成的关键基因AoCerS表达水平上调，中性鞘糖脂含量增加，且与菌丝融合相关基因也被强烈诱导表达，更有利于逆境信号的转导，增强细胞适应温度胁迫的能力。本研究为探讨鞘糖脂合成关键基因响应温度胁迫的分子机制奠定了坚实的基础，鉴定的鞘糖脂合成关键基因功能也为通过分子生物学手段改变鞘糖脂代谢流提高中性鞘糖脂产量奠定理论基础。项目资助发表sci论文5篇。