高盐胁迫下米曲霉A-F02中草甘膦降解限速酶分子空间构象的变化与作用机制

转基因大豆中草甘膦的残留、加工过程中的消长及危害已逐渐受到广泛重视。课题组研究发现，米曲霉具有比细菌更显著的降解草甘膦能力。本研究拟从前期研究所获高效降解草甘膦的米曲霉Aspergillus oryzae sp.A-F02中，分离纯化草甘膦降解酶、克隆其合成基因、构建打靶载体、敲除靶基因，获得草甘膦降解代谢途径中催化限速反应的限速酶；分析该限速酶的酶学性质，对其结构进行表征；分析草甘膦对该限速酶分子结构和空间构象的影响，并建立草甘膦降解限速酶的降解动力学模型；通过基因定点敲除技术分析限速酶活性中心组成及其对酶催化功能的影响，阐述米曲霉中草甘膦降解限速酶的酶促反应机理；模拟高盐稀态酱油发酵条件，从分子水平上阐述高盐浓度胁迫下米曲霉中草甘膦降解限速酶分子活性中心组成和空间构象的变化及其作用机制，为米曲霉发酵转基因大豆生产酱油生产中，消除草甘膦残留提供理论研究基础。

转基因大豆中草甘膦的残留、加工过程中的消长及危害已受到广泛重视。本研究通过比较选用柱前衍生-高效液相色谱法用于草甘膦含量测定。从前期研究筛选的具有降解草甘膦能力的米曲霉Aspergillus oryzae A-F02为出发菌株，通过紫外诱变选育，使其产胞内草甘膦降解酶能力提高14倍。. 通过NCBI基因库比对以及草甘膦代谢途径分析，选取甘氨酸氧化酶基因为草甘膦降解酶候选基因。提取米曲霉基因组DNA，PCR获得甘氨酸氧化酶基因片段，通过基因克隆技术，将其导入毕赤酵母表达系统中，得到含甘氨酸氧化酶基因的毕赤酵母表达菌株GS115-AFGO。. 采用GC-MS分析H2O2降解草甘膦的中间代谢产物，推测其有C-P键断裂、C-N键断裂2条降解途径。通过米曲霉降解草甘膦的代谢途径产物分析，判断其代谢途径为C-N键氧化断裂生成氨甲基膦酸途径。分别监测不同草甘膦初始浓度下、添加AMPA和甲胺这两种中间代谢产物，分析草甘膦、AMPA和甲胺浓度动态变化，确定限速反应为降解草甘膦生成AMPA的代谢反应。. 草甘膦诱导的Aspergillus oryzae A-F02菌丝经液氮研磨、硫酸铵沉淀、 Sephadex G-50、DEAE-Sephadex A-50柱层析，获得有酶活产物经SDS-PAGE电泳条带显示单一条带，鉴定为纯草甘膦降解酶。酶学性质分析表明，草甘膦降解酶最适反应pH为7.0、最适反应温度为37℃。底物对酶促反应速率研究表明，酶促反应为竞争性抑制。. 模仿酱油发酵高盐浓度，采用15、20%两种盐浓度下胁迫处理草甘膦降解酶10 小时，酶活力分别下降1/2和2/3。高盐浓度胁迫会改变对草甘膦降解酶空间结构，也引起酶活力的降低。原因可能为高盐浓度产生高离子浓度作用，破坏了草甘膦降解酶分子的水化作用，影响其分子官能基团的电离度，与微环境间相互作用力，如氢键的数量。从而改变草甘膦降解酶分子二级结构中螺旋与折叠的比例，导致其二级和三级结构发生不同程度的改变，引起活性中心构象改变，从而减弱了草甘膦降解酶分子与底物的接近、结合作用，导致酶催化活性降低。. 从分子水平上阐述高盐浓度胁迫下米曲霉中草甘膦降解酶空间构象的变化及其酶活之间作用机制，为在米曲霉发酵转基因大豆生产酱油生产中，消除草甘膦残留提供理论研究基础。