生防菌短短芽孢杆菌X23中非核糖体肽类抗生素Edeines的生物合成途径研究

Edeines are non-ribosomal peptides produced by Brevibacillus brevis with high- efficiency and broad-spectrum antimicrobial activity, while the use of edeines was limited due to the high cytotoxicity to animals. Structural modification or variation of edeines is an effective way to reduce its cytotoxicity. As the biosynthetic mechanism of edeines is not yet clear, researchers can only obtain its structural derivatives by costly and complex method of chemical synthesis. Brevibacillus brevis X23, an excellent antagonistic bacterium with broad-spectrum antimicrobial activity isolated by our group, has been confirmed to produce edeine A and edeine B in previous work. The genome sequence of Brevibacillus brevis X23 has been finished. And, after development of the genetic manipulation system of this strain, the biosynthetic gene cluster for edeines was identified in the genome of Brevibacillus brevis X23 for the first time by gene disruption. Basing on bioinformatics analysis, we will try to reveal synthetic mechanism for the precursors of edeines, especially for the unique precursor DAHAA, by means of gene knockout, ATP-32PPi exchange, feeding with isotope labeled precursor and in vitro enzyme test, and illustrate the whole biosynthetic pathway of edeines. The results of this study will provide a theoretical basis and guidance for modification of the biosynthetic pathways to obtain edeine derivatives with reduced cytotoxicity, and will provide alternative resources for development of new medical or agricultural antibiotics.

Edeines是短短芽孢杆菌产生的非核糖体肽类抗生素，抗菌活性强、抗菌谱广，但是较高的细胞毒性限制了其应用。对Edeines进行结构改造或修饰是降低其细胞毒性的有效途径，然而由于它的生物合成机制尚未明确，研究人员只能通过成本昂贵且复杂的化学合成获得其结构衍生物。短短芽孢杆菌X23是我们分离到的广谱拮抗菌，前期研究表明该菌能高效产生Edeine A和Edeine B。我们已经完成了该菌的全基因组测序和遗传操作体系建立，并首次通过基因敲除的方法确定了Edeines的生物合成基因簇。本研究将在生物信息学分析的基础上，采用基因敲除、ATP-32PPi交换、同位素标记前体饲喂和酶的体外试验等手段解析各个前体（特别是独有前体DAHAA）的生物合成机制，阐明Edeines的生物合成途径。本研究将为利用生物合成途径改造获得毒性降低的Edeine结构衍生物提供理论指导，为医用或农用抗生素开发提供备选资源。

伊短菌素是短短芽孢杆菌产生的线性非核糖体肽类抗生素，具有抑菌谱广和抑菌活性强等特点，但是较高的细胞毒性限制了其应用。对伊短菌素进行结构改造或修饰是获得低细胞毒性衍生物的有效途径，然而由于它的生物合成机制尚未明确，目前还只能通过化学合成获得其结构衍生物，其成本昂贵，且方法复杂、繁琐。.为了解析伊短菌素的生物合成途径，并讨论通过合成生物学方法产生新的结构衍生物的技术可行性，本项目开展了以下研究。首先通过生物信息学分析、基因敲除和平皿对峙培养确定了伊短菌素的生物合成基因簇（edeine biosynthesis gene cluster，ede BGC），然后对6个非核糖体肽合成酶中的ATC结构域进行了异源表达，经体外实验解析了6个腺苷酰化结构域（adenylation domain， A domain）的底物特异性，首次证明了6个非核糖体合成酶EdeP/N/L/K/J/I的氨基酸类底物分别是L-Asn、L-Tyr/L-Phe、异丝氨酸（isoserine）、2,3-二氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸/L-Lys和L-Gly。其次，项目组通过基因敲除/回补和LC-MS分析等方法，明确了伊短菌素生物合成途径中edeA、edeB和edeF等关键基因的功能，并且通过前体饲喂获得了一个伊短菌素的新衍生物，该衍生物对茄科作物青枯菌和枯草芽孢杆菌均具有良好的抑菌活性。第三，分别用6个强表达的启动子替换了ede BGC的天然启动子，获得了6株高产伊短菌素的工程菌株，定量分析结果表明6株工程菌株的伊短菌素A/B的产量均显著提高，相比于野生型菌株，产量增幅介于3.6±0.1至8.7±0.6倍之间，为后续基于系统工程学方法进一步改造伊短菌素的生物合成途径，以实现更高产量进行了有益的探索。综上，本项目的研究解析了伊短菌素的生物合成途径，创制了新的结构衍生物，并构建了高产工程菌株。项目研究结果不仅可以为获得新的伊短菌素结构衍生物奠定理论基础和提供技术指导，还将为新型农用抗生素的开发提供候选菌株及化合物资源。