轮状病毒四种蛋白的梯度控制释放及免疫研究

人轮状病毒是引起婴幼儿急性脱水性腹泻的主要原因，目前仍然是造成的婴幼儿疾病和死亡的主要原因。迄今没有有效的灭活和基因工程疫苗，目前使用的减毒活疫苗存在着疫苗株病毒毒力回复的安全性问题。针对轮状病毒血清型多变，基因易发生重排等特点，必须采取一种有效、安全的抗原递送方式，达到与减毒活疫苗类似或更好的免疫效果。项目通过对轮状病毒中的三种结构蛋白VP4、VP6与VP7及非结构蛋白NSP4的梯度联合免疫实现对轮状病毒的免疫，设计合成侧链带氨基（或羧基）的功能性生物降解材料，对轮状病毒四种蛋白进行包裹制备成微球，根据病毒蛋白结构分别选择对应其性能的材料，以改善对病毒的相容性及稳定性，然后把四种蛋白微球按比例混合，参考病毒在生物体内复制机理，利用各种材料自身降解性能的差异实现体外梯度联合控制释放，以小白鼠为对象，进行梯度控制释放及免疫研究，为开发基因工程疫苗奠定技术基础，促进药物控制释放体系研究的发展。

人轮状病毒（human rotavirus, HRV）是引起3个月—5岁婴幼儿急性脱水性腹泻而入院或者死亡的主要原因。据统计，因感染A组轮状病毒导致婴幼儿急性胃肠炎，每年死亡人数超过45万人。目前市售的减毒灭活口服疫苗存在着稳定性差、安全性能差以及有效时间短的不足。本论文中，采用不同的可生物降解高分子材料来制备轮状病毒SA11微球疫苗，并对其进行体外及体内的研究。.首先，以疏水性聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为载体材料，制备出RV-PLGA微球。本实验制备过程中，在内水相和外水相中添加稳定剂蔗糖以提高抗原的包埋率；当油相和外水相的比例为1/4时，抗原包埋率能达到43.41±1.61%；当聚合物浓度控制在160mg/mL，抗原包封率为35.67±1.66%。通过扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）的观测，微球成球性好，表面光滑。.其次，选用在聚乳酸中引入亲水基团的聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA）为载体，制备RV-PELA微球。通过SEM观测微球形貌、激光粒度分析仪测定微球粒径分布，进行体外释放和降解行为测定。采用不同剂量对小鼠进行免疫实验，用ELISA法检测不同免疫时间的抗体水平差异。结果显示RV-PELA微球外表平整，抗原能够在小鼠体内产生免疫效果，能达到缓释的目的。.最后，制备了星形的可生物降解材料聚乳酸-4-arm-PEG共聚物（4-arm-PELA）并以其为载体材料制备RV-4-arm-PELA微球。实验中，先以DMAP作为催化剂，用大分子4-arm-PEG引发乳酸OCA开环聚合，制备星形聚合物4-arm-PELA并对其进行表征。在不添加任何稳定剂的条件下，采用双乳液体系制备RV-4-arm-PELA微球，结果显示抗原的包封率达到43.78±1.35%。抗原的体外释放及微球的体外降解实验表明抗原的释放速度缓慢、突释效应不明显，材料的降解速度缓慢。小鼠体内的免疫效果显示，星形聚合物作为药物控制释放材料具有更好的应用前景。