内源性和外源性绵羊肺腺瘤病毒ENV蛋白在绵羊肺腺瘤病致瘤中的作用研究

绵羊肺腺瘤病（OPA）是由绵羊肺腺瘤反转录病毒（exJSRV）引起的一种肺脏肿瘤性传染病。该病随优良品种的引进而带入，对我国养羊业特别是种羊生产危害极大。近年来对绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白（ENV）在该病分子发病机理的研究上取得了一些进展，但仍有重要的基础问题尚不完全清楚。本课题在前期研究的基础上，重点探索绵羊肺腺瘤发病过程中外源性exJSRV病毒和内源性enJSRV病毒中env基因编码的ENV蛋白分别发挥什么作用？二者的作用关系如何？我们设计体内（in vivo）和体外(in vitro)试验，这些问题在体外培养的293T细胞和滋养层细胞中进行探索，在动物体内进行证实。回答这些问题为深入探究存在于绵羊基因组的enJSRV病毒的生物学功能，为深入阐明绵羊肺腺瘤病毒内蒙株所致OPA的分子发病机理及找到有效的防控靶点具有重要的理论意义和应用价值。

该项目严格按照计划任务书执行，完成了预期的研究目标。已发表了相关学术论文19篇，申请专利技术1项。培养博士研究生1名，硕士研究生4名。具体研究成果概述如下：完成不同孕期绵羊胎盘滋养层细胞的体外培养鉴定，多核滋养层细胞的体外培养以及滋养层细胞的永生化研究，利用密度梯度离心法和免疫磁珠法纯化绵羊绒毛膜滋养层细胞，采用电转染法将编码hTERT 和neo基因的真核表达质粒 pCI-neo-hTERT 导入纯化后的绵羊绒毛膜滋养层细胞中。永生化的绵羊绒毛膜滋养层细胞在体外长期连续培养下，生长良好，传代达50多代，可以表达绵羊肺腺瘤病毒（enJSRV）囊膜蛋白，仍具有正常的细胞增殖周期和接触抑制性；成功构建外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因的质粒（pcDNA3.1(+)/exJSRV-env和pEGFP-C1/exJSRV-env）和内源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因的质粒（pEGFP-C1-enJSRV-env质粒和pcDNA3.1--enJSRV-env）以及其受体Hyal2的质粒（pEGFP-C1-Hyal2质粒和pcDNA3.1-Hyal2）；完成外源性和内源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因的重组质粒转染293T细胞、NIH3T3 细胞和体外培养的绒毛膜滋养层细胞的研究；将质粒pEGFP-C1/enJSRV-env、pEGFP-C1/Hyal2、干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR /enJRSV-env-shRNA按照最佳电转染条件分别转原代绵羊绒毛膜滋养层细胞中，结果转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒和共转染pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2的多核绒毛膜滋养层细胞个数与转染空质粒的实验组比较均存在差异极显著，说明内源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在绵羊绒毛膜滋养层细胞的融合发育中起到重要作用。进行了外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达质粒体内转化和致瘤的研究，结果质粒pcDNA3.1(+)/exJSRV-env引起NIH3T3细胞发生转化，pcDNA3.1(+)/exJSRV-env转染的NIH3T3细胞接种裸鼠使裸鼠致瘤，质粒pcDNA3.1/exJSRV-env用体内转染试剂经尾静脉注射到幼龄Balb/c小鼠体内，引起肝细胞出现大面积弥散性坏死和肺间质细胞增生等病变，证实绵羊绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白可引起细胞发生转化和癌变的能力。