内源性绵羊肺腺瘤病毒在绵羊发育过程中的作用初探

在前期的研究中，内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)可高度表达在绵羊的生殖道和妊娠的子宫内，提示enJSRV对宿主的作用是有益方面大于有害方面，但目前对绵羊在发育过程中的确切作用还未清楚。本项目的提出是在上述研究的基础上运用RNA干扰诱导基因沉默技术观察绵羊妊娠早期滋养层细胞的变化，揭示enJSRV在妊娠早期可能发挥的作用；运用荧光定量PCR技术、组织原位分子杂交技术检测绵羊妊娠早、中、晚期enJSRV及其受体Hyal-2在子宫、胎盘、孕体中的表达量的变化规律以及表达定位。研究结果对揭示enJSRV在绵羊发育过程中，特别是胎盘的发育和孕体的生长分化中的调节作用奠定重要的理论基础。enJSRV作为哺乳动物内源性逆转录病毒（ERV）的代表，它的生物学作用为揭示与宿主之间的进化关系以及生存选择等提供新的理论依据。同时研究成果将对动物的生存、发育、繁殖等具有重要的应用价值和理论意义。

该项目严格按照计划任务书执行，完成了预期的研究目标。已发表了相关学术论文13篇。培养博士研究生1名，硕士研究生4名，参加全国学术会议3次和做3次学术报告。具体研究成果概述如下：体外成功培养了绵羊绒毛膜滋养层细胞并通过形态学、免疫组织化学染色、透射电镜及RT-PCR技术进行了培养细胞的鉴定。设计并合成了4个siRNA 靶序列，构建抑制enJSRV-env基因的RNA干扰质粒，并将其转染到能稳定表达enJSRV-env基因绵羊绒毛膜滋养层细胞中，当Lipofectamine® LTX脂质体为6.0µL，转染混合物为100µL，转后48h组转染效率最高达42.37%。通过荧光定量PCR检测其干扰效率，筛选出一个干扰效率最高(73.56%)的RNA干扰质粒enJRSV-env-shRNA-1。实时荧光定量 RT-PCR 技术检测了 enJSRV及其受体 HYAL2 mRNAs 在不同妊娠时期（30d、50d、70d、90d、110d 和 130d）蒙古绵羊子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎中均有 enJSRV 及其受体 HYAL2 的表达，SAS 统计学软件分析胎盘组织中enJSRV的表达于 90d 时达到高峰；子宫内膜组织和绒毛膜组织中其表达变化也具有规律性；而 HYAL2 mRNA 的表达于妊娠 30d 子宫内膜和胎盘相对较高，且 enJSRV 与其受体 HYAL2 mRNA 之间的表达无线性相关性。组织原位杂交技术检测了 enJSRV 及其受体 HYAL2 mRNAs 在不同妊娠时期（30d、50d 和 130d）蒙古绵羊子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎组织的空间定位，结果显示 enJSRV 及其受体 HYAL2 mRNAs 在待检组织中均有阳性信号出现，且均特异性表达在腔上皮细胞（LE）、腺上皮细胞（GE）、血管内皮细胞（V）、间质（S）、滋养层巨型双核细胞（BNC）、多核合胞体小半鞘翅（SP）、滋养外胚层（Tr）、肉阜（Car）、胎盘绒毛叶（Cot）及妊娠 30d 的胚胎组织。实时荧光定量 PCR 检测enJSRV在妊娠早期（第2、8、10、12、14、16、19、25和30 d）蒙古绵羊子宫内膜、宫颈、输卵管、阴道上皮组织均有表达，SAS 统计学软件分析说明子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达与外周血孕酮含量及IFN-τ 的变化呈正相关。