新现人兽共患病原菌猪链球菌组氨酸三聚体家族蛋白对细菌致病性的作用及促进细菌免疫逃避的机制研究

猪链球菌（S. suis）是一种危害全球的新现人畜共患病病原菌。1998及2005年分别在我国江苏和四川等市县人群中先后爆发了S. suis 2感染人的疫情，导致严重的公共卫生事件。目前对S. suis 2致病机制尚不明确。前期研究发现S. suis 2强毒株05ZYH33基因组中存在链球菌特有的、免疫逃避相关的组氨酸三聚体蛋白（Htp）编码基因。证实S. suis 2基因组编码3个Htp家族蛋白，并率先展开了对S. suis 2中该家族蛋白生物学功能的研究。本研究拟通过构建htp基因敲除突变株，比较突变株与野生株在形态特征、毒力等方面的差异，以期阐明htp基因与该菌强致病性的关系；通过原核表达系统获得该家族的三个活性蛋白，探讨该家族蛋白在疫苗开发方面的价值，并通过蛋白与补体因子的相互作用，进一步阐明该家族蛋白在S. suis 2免疫逃避中发挥的作用，为分子疫苗和靶标药物设计提理论指导。

2型猪链球菌（SS2）是一种危害全球的新现人畜共患病病原菌。1998及2005年在我国江苏和四川部分市县人群中先后爆发了SS2感染人的疫情，导致严重的公共卫生事件。目前对SS2致病机制尚不明确。申请人前期在对SS2致病机制研究的过程中发现SS2强毒株05ZYH33基因组中存在链球菌特有的、免疫逃避相关的组氨酸三聚体蛋白（HTP）家族基因。通过进一步分析，发现SS2基因组中共编码3个HTP家族蛋白，并率先展开了对SS2中该家族蛋白生物学功能的探索。为了深入揭示HTP蛋白的生物学功能以及它们在SS2致病过程中的作用，本项目通过基因敲除、蛋白表达、动物实验和转录组测序等方法对SS2中的HTP家族基因进行了系统研究。利用基因敲除手段分别构建了2个htp基因htpsA和htpsC的突变株△htpsA和△htpsC。比较突变株和野生株形态特征和致病性发现，△htpsA与野生型相比荚膜变薄、成链能力明显下降，△htpsA的全血存活能力、抗鼠巨噬细胞吞噬能力和对Hep-2人喉癌上皮细胞黏附能力都明显下降；△htpsC形态特征与野生型相比并没有很大差异，但是其对细胞外基质和Hep-2的粘附能力均明显降低；动物实验表明△htpsA和△htpsC对小鼠致病性显著降低，表明htpsA和htpsC在SS2致病过程中发挥重要的作用。为了进一步研究htpA基因缺失影响SS2表型和致病性的分子机制，我们对△htpsA的转录组进行了测序，并与野生型菌株的转录组进行比较。结果发现，△htpsA中大量与糖类代谢相关的基因表达发生了明显变化，这可能是导致其荚膜合成能力变弱的原因；同时，一些毒力基因表达量的降低则可能导致了△htpsA致病性的下降。由于htpsC基因的缺失影响了SS2与细胞外基质以及Hep-2的粘附，表明HtpsC蛋白作为一个粘附因子直接介导了SS2与宿主蛋白的相互作用。通过分别表达HtpsC氨基端HTP结构域和羧基端LRR结构域，进一步发现HTP和LRR结构域分别具备对层粘连蛋白和纤连蛋白的高亲和力。为了评价HTP蛋白作为疫苗候选分子的潜力，分别使用三种重组HTP蛋白免疫小鼠，发现三个蛋白对小鼠都有显著的免疫保护作用，表明HTP蛋白可以作为SS2疫苗开发的候选分子。本项目取得的成果不仅揭示了HTP蛋白在SS2致病过程中的作用，还为SS2的预防和治疗拓宽了思路。