重要人兽共患病原菌-2型猪链球菌中国强毒株反应调节因子CovR调控靶基因的筛选及其调节机制的研究

2型猪链球菌(SS2)是一种重要的人兽共患病病原，所致中毒性休克综合征是病死率极高的人类新现感染性疾病。我国江苏(1998)、四川(2005)曾暴发较大规模猪群及从业人群感染，严重威胁公共卫生安全，其高致病性分子基础尚未阐明。我们研究发现SS2中国强毒株基因组中存在反应调节因子covR，经基因敲除、动物实验及基因芯片等系统研究表明，其为全面调节基因表达的负调控因子，直接或间接调节8.9%的基因的表达，其中包括一些已知的或潜在的毒力因子基因，对细菌致病性具有重要的调节作用。为进一步了解CovR对SS 2致病的调控作用，本研究拟通过原核表达CovR蛋白并制备其单克隆及多克隆抗体后，运用蛋白-DNA结合实验(EMAS)和染色质免疫共沉淀实验筛选CovR直接调控的致病基因；通过DNA足迹法确定CovR结合序列，筛选CovR调控的靶基因并研究其调控作用机理，揭示SS 2中国强毒株高致病性的分子机理。

本课题已按研究计划顺利完成。.　　2 型猪链球菌(S. suis2)是一种重要的人兽共患病病原，所致中毒性休克综合征是病死率极高的人类新现感染性疾病。我国江苏(1998)、四川(2005)曾暴发较大规模猪群及从业人群感染，严重威胁公共卫生安全，其高致病性分子基础尚未阐明。我们研究发现S. suis2中国强毒株基因组中存在反应调节因子covR，经基因敲除、动物实验及基因芯片等系统研究表明，其为全面调节基因表达的负调控因子，直接或间接调节8.9%的基因的表达，其中包括一些已知的或潜在的毒力因子基因，对细菌致病性具有重要的调节作用。为了进一步研究在这些受covR调控的基因当中，covR蛋白结合在哪些靶基因的启动子区，通过直接相互作用调控了基因的表达水平，我们进行了本项研究。本研究通过体外表达并纯化获得高纯度的covR重组蛋白；以重组蛋白为抗原分别免疫小鼠和新西兰兔制备了高效价、特异性的单克隆和多克隆抗体。在这两项工作的基础上，我们通过凝胶迁移率变化实验和染色质免疫共沉淀实验对covR直接调控的基因基因进行了筛选，成功获得了两个covR直接调控的靶基因。我们还对靶基因启动子区是否存在保守的covR结合区域进行了分析和实验鉴定。在以上工作顺利完成的基础上，我们又对研究内容作了一定程度的拓展。首先，我们对可能参与covR蛋白磷酸化的STK/STP系统进行了体外表达和体内敲除；其次，我们对两个可能与covR存在cross-talk的调控因子的生物学功能进行了研究；最后，我们对多个受covR调控的靶基因的生物学功能进行了研究。这些工作的完成不仅加深了我们对covR调控猪链球菌致病性机制的认识，还为我们从更深和更广的层面研究猪链球菌的致病机制拓宽了研究思路。. 在本项目资助下，已发表论文28篇，其中SCI收录论文5篇。获中华医学科技奖一等奖、中华预防医学会科学技术奖一等奖及江苏省科学技术奖三等奖各1项。已获得授权专利1项，公开发明专利4项。培养博士2名，硕士生8名，南京军区卫生专业人才培养“122工程”全军级学科带头人1名。