人兽共患病原链球菌毒力调控因子CovR磷酸化机制研究

Streptococcus suisserotype 2 (S. suis 2) is an important swine pathogen andemerging zoonotic agent. The streptococcal toxic shock syndrome (STSS) caused by S. suis 2 is a serious disease that has high mortality. So far, thepathogenesis of S. suis 2 infection is not well understood.Our previous studies have found that the orphan response regulator CovRglobally regulates gene expression and negativelycontrols virulence of S. suis2 Chinese virulent strain 05ZYH33, a STSS-causing strain.S. suis 2, how CovR isphosphorylated and activated still unknown. Serine-threonine kinase (STK) has been reported to involve in phosphorylation of proteins in many bacteria. A STK encoding gene has also been identified in our previous study. To determine the role of S. suis2STK in CovRphosphorylation, we proposed the following plan. First, based on the expression ofrecombinantCovR and STK, both in vitro and in vivo experiments will be adopted to test the phosphorylation of STK on CovR; then the phosphorylation site of CovR by STK will be determined with phos-tag gel analysis and mass spectrometry; finally, a CovRphosphorylation site mutant of S. suis 2 will be constructed, to evaluate its effect on the virulence of S. suis 2. We believe this plan will provide new insight into the molecular mechanism of the pathogenicity of S. suis 2.

2型猪链球菌(S.suis 2)是一种重要的人兽共患病病原，所致中毒性休克综合征是病死率极高的人类新现感染性疾病。目前对其高致病性的分子基础尚未阐明。申请人之前对S.suis 2中国强毒株研究发现，调节因子CovR对细菌致病性具有重要的调控作用，但对其如何被磷酸化而激活的机制尚不清楚。丝/苏氨酸激酶（STK）是在多种细菌中发现的参与调节因子磷酸化的蛋白。申请人在S.suis 2中国强毒株中发现了STK同源基因。然而，其是否发挥对CovR的磷酸化并不清楚。因此，本项目拟制备具生物活性的CovR和STK重组蛋白，通过体内、外实验探究STK对CovR的磷酸化作用，运用phos-tag凝胶技术以及蛋白质谱技术，鉴定STK磷酸化CovR的位点；通过构建CovR磷酸化位点突变株，研究CovR磷酸化失活对S.suis 2致病性的影响，从而深入揭示CovR调控S.suis 2中国强毒株高致病性的分子机理。

猪链球菌（S. suis）是一种人兽共患病病原菌，在其29种血清型中S. suis 2致病性最强。因此，S. suis 2的致病机制一直是研究热点之一。申请人前期研究发现S. suis 2 CovR是一个孤儿反应因子，而且是全面调节基因表达的负调控因子，受其调控的下游靶基因可能涉及多个已知毒力因子及潜在的毒力因子。为了进一步阐明磷酸化对于CovR蛋白发挥功能的调控作用，本项目通过原核表达、体内外磷酸化鉴定、突变株生物学性状检测等实验，系统的对CovR进行了研究。体外磷酸化实验表明CovR可以被STK蛋白磷酸化；在大肠杆菌反应体系中CovR蛋白也可以被STK磷酸化。质谱磷酸化结果显示CovR蛋白的第45、148、150、159、168、194、219位苏氨酸残基，第40、172、215位丝氨酸残基以及第225位酪氨酸残基被STK磷酸化，将其磷酸化位点突变为丙氨酸后，蛋白不显示磷酸化信号。分别将正常的covR基因及发生磷酸化的苏氨酸位点被突变的covR基因转入covR突变株，构建野生回补株covR-WT和苏氨酸残基突变位点回补突变株covR-T，回补株covR-WT和covR-T的生长速率基本相似，说明CovR蛋白苏氨酸磷酸化不影响细菌的生长；点回补突变株covR-T的粘附能力下降，抗吞噬能力增强，CovR蛋白苏氨酸磷酸化影响细菌的粘附和抗吞噬能力。本研究还首次揭示了S. suis 2 STK具备酪氨酸激酶活性，可磷酸化CovR蛋白的酪氨酸残基。此外，蛋白质磷酸组学以及体外磷酸化实验均证明DivIVA是STK的另一磷酸化底物。通过这些研究，进一步揭示了孤儿反应调节因子CovR发挥生物学功能的分子机制以及S.suis2不同调控系统之间发生的cross-talk，为深入理解S. suis 2致病机制以及S. suis 2流行的防治提供了理论指导。