cofD基因敲除对瘤胃甲烷菌中辅酶F420生物合成途径和产甲烷活性的影响

Greenhouse gases mitigation is recently the hot spot worldwide, and methane is one of the most greenhouse gas. Ruminant rumen methanogens utilize hydrogen to reduce carbon oxide to form methane. Till now, there is no long lasting and effective methods or technologies available to decrease methane production in ruminant husbandry. Coenzyme F420 is the key enzyme of this pathway, CofD enzyme is the forth enzyme in the biosynthesis of coenzyme F420. Therefore, we speculate according to the present advancement that cofD gene, CofD enzyme and coenzyme F420 maybe among the key regulating points on methane production activities, forming effective inner regulate pathways, and finally affect methanogenic activities. Two kinds of methanogens, ，Methanobrevibacter ruminantium and Methanobacterium formicicum，which with different levels of coenzyme F420 will be selected, and gene knockout technology will be adopted to construct gene deficient models. And then, the difference between wild types and mutants CofD enzyme expression and activities will be compared, the difference between the biosynthesis of coenzyme F420 and regulating function in methane production will also be compared. All of the results obtained will provide novel information to investigate methanogens metabolism activities and new target for methane mitigation.

温室气体的减排一直是近年来研究的热点问题，CH4是重要的温室气体，反刍动物瘤胃甲烷菌主要利用H2还原CO2生成甲烷，目前对甲烷菌外部调控减排措施只能短期有效，辅酶F420是该途径所需的关键辅酶，CofD酶是合成辅酶F420的第四个酶，根据目前的研究进展推测： cofD基因、CofD酶和辅酶F420是调控甲烷菌产甲烷活性的关键调控点，并形成有效的内部调控途径，影响甲烷菌的产甲烷活性。本项目拟选用高辅酶F420含量的甲酸甲烷杆菌和低辅酶F420含量的反刍兽甲烷短杆菌，采用基因敲除手段构建CofD酶缺乏的两种甲烷菌，比较研究野生型和cofD基因敲除型的两种甲烷菌的CofD酶的表达量及活性的差异，与此相关的辅酶F420的生物合成及在甲烷生成途径中调控作用的差异，从而为进一步研究甲烷菌的代谢活性和有效调控反刍动物甲烷排放寻找新靶点和提供新的调控途径。

反刍动物瘤胃甲烷减排一直是近年来的研究热点问题，本项目研究表明甲烷短杆菌属是肉牛瘤胃中的绝对优势甲烷菌属（>95%），其中低丰度的RO簇甲烷菌反刍兽甲烷短杆菌的产甲烷活性和对低氢浓度环境的适应能力较高。瘤胃甲烷菌主要利用H2还原CO2生成CH4，其中辅酶F420是这一主要甲烷生成途径的关键辅酶，而cofD酶是辅酶F420生物合成过程中的最后一个酶。本项目从肉牛瘤胃液中分离鉴定了辅酶F420含量不同的两种产甲烷菌：反刍兽甲烷短杆菌和甲酸甲烷杆菌，并构建了其cofD基因敲除体。.扩大培养后研究发现：cofD基因敲除后，在培养24、36小时，反刍兽甲烷短杆菌的cofD基因表达量分别比野生型的丰度低69%和57%；在36、48、96小时，辅酶F420的含量比野生型降低了29%、29%、30%；最大H2消耗量和生成的最大CH4产量分别是野生型的14%和2%；在24、36、48小时，cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌的丰度也分别比野生型低69%、23%和39%。表明cofD基因敲除能显著降低反刍兽甲烷短杆菌的生长增殖能力、cofD基因表达量、辅酶F420含量、mcrA基因含量、H2消耗量和CH4产量。.cofD基因敲除后甲酸甲烷杆菌的辅酶F420的含量显著下降，在24、36、96时，比野生型降低了71%、63%、67%，但对其生长增殖能力、H2消耗量和CH4生成量都无显著变化。.综上所述，cofD基因敲除后，产甲烷优势菌群反刍兽甲烷短杆菌和甲酸甲烷杆菌辅酶F420含量均显著降低，且对甲酸甲烷杆菌的影响幅度大于反刍兽甲烷短杆菌，并导致反刍兽甲烷短杆菌的增殖能力和甲烷产量降低，但对甲酸甲烷杆菌的增殖和甲烷产量无显著影响。表明cofD基因介导的利用H2生成甲烷的途径是反刍兽甲烷短杆菌产生甲烷的主要途径，辅酶F420在其中起了关键的调控作用，而甲酸甲烷杆菌可能利用甲酸为底物生成甲烷，因此cofD基因敲除导致辅酶F420含量的降低对其产甲烷能力影响不显著。.本项目揭示了cofD基因调控的CofD酶和辅酶F420的变化在不同产甲烷菌中的调控作用，为进一步研究甲烷菌的代谢活性和有效调控反刍动物甲烷排放提供了新靶点和调控途径。