产甲烷新途径及参与此途径功能菌菌群结构组成解析研究

在厌氧产甲烷系统中各种微生物组成了一个复杂的互营代谢微生态系统。此微生态系统中既包括一级和次级发酵菌、产乙酸菌和产甲烷菌等已知菌种，同时还存在其他未被认知的新菌种。例如本课题提出的在无其他电子受体(如硫酸根、硝酸根等)存在的条件下甲酸、乙酸氧化菌和氢氧化菌等未被认知的新菌种。此方面的研究将进一步完善产甲烷途径，阐明产甲烷机理，揭示功能菌菌群结构组成，具有重要科学意义。.本研究分别以甲酸、乙酸和氢气+二氧化碳为底物对不同环境样品进行产甲烷互营代谢菌群的优化培养。利用454焦磷酸测序、碳14示踪、DNA-SIP、T-RFLP、克隆及FISH等分子生物学技术对产甲烷路径、菌种多样性和菌落的结构组成等进行研究并进行新菌种分离。最终证明和验证甲酸、氢和乙酸氧化菌新生态位的存在，阐明这些新菌种参与产甲烷的路径与机理，解析参与此途径菌种多样性和菌群结结构组成，获得新菌种及其生理生化特性等方面的信息。

在厌氧反应体系中，对于简单底物如二氧化碳类型底物、甲基类型底物和乙酸类型底物，产甲烷菌可直接利用。然而其菌群结构却不是那没简单，很多新的生态位仍然未被人们所认知。本课题选择甲酸、乙酸、H2/CO2和苯甲酸为唯一碳源，对厌氧消化污泥进行了传代培养，考察了单一碳源胁迫下厌氧活性污泥产甲烷特征和群落演替规律。同时增加了相对复杂有机底物如对苯二甲酸、发酵液和剩余污泥厌氧产甲烷特性研究及微生物菌群分析等研究内容。课题得到以下重要研究结果与结论：. （1）在甲酸体系中，基因对比试验证实，系统中存在甲酸氧化菌。说明在以甲酸为碳源厌氧产甲烷过程中，不仅存在产甲烷古细菌直接利用甲酸产甲烷这一途径，系统中还会形成多样的代谢途径。其中包括甲酸氧化细菌氧化甲酸，并与产甲烷古菌形成互营代谢系统，完成甲酸在厌氧环境的代谢过程；. （2）证实了在以乙酸为单一碳源的系统中存在乙酸氧化细菌，这部分细菌与产甲烷菌互营产甲烷。即乙酸氧化菌首先氧化乙酸生成二氧化碳和氢气，产甲烷菌利用CO2+H2再产甲烷。但在本实验中，这种途径不占优势；. （3）在CO2+H2体系中，虽然营养物质很简单，但是其菌群结构较甲酸、乙酸系统都要复杂得多，细菌多样性较丰富。菌群分析表明，系统中存在同型产乙酸路径。同时实验结果还表明，系统中存在与产甲烷菌共生的、有丁酸降解功能的丁酸共营氧化菌，此结果证明在CO2+H2体系中，存在氢氧化菌将H2+CO2氧化成有机物如乙酸、丁酸。同时系统中还存在一些菌种尚不清楚其功能特性，有待进一步研究。. （4）苯甲酸系统中，氧化菌在克隆数量上占绝对优势，形成与产甲烷菌共营代谢路径。. （5）在对苯二甲酸系统中，菌株Syntrophorhabdus_aromaticivorans与乙酸型产甲烷菌Methanosaeta被确认是中温下TA降解的优势功能菌群。. （6）发酵液体系中厚壁菌门的相对丰度最高，根据实验结果可以推断此菌门在有难件解废水处理中起到了关键的作用。. （7）剩余污泥厌氧发酵过程中重要产酸优势菌属为Bacillus、Clostridium和Peptostreptococcaceae。